膀胱癌类器官与T细胞共培养的培养体系及方法与流程

本发明涉及生物医药技术药物，具体涉及膀胱癌类器官与t细胞共培养的培养体系，还涉及所述培养基在体外快速评估t细胞对肿瘤杀伤力的方法。

背景技术：

1、大多数膀胱癌是尿路上皮癌，其中大多数是非肌肉浸润性膀胱癌，通常预后相对较好，但与较高的发病率和治疗管理成本相关。这些非肌肉侵袭性肿瘤可分为低级别或高级别，并包含多种生长模式，包括乳头状肿瘤和原位癌，一种扁平的发育不良细胞层，被认为是肌肉型的常见前体。膀胱癌的治疗方案及其疗效因临床分期和相关危险因素而异。非肌肉侵袭性膀胱癌的一线治疗是经尿道切除术，根据疾病分期、分级和其他临床特征，伴或不伴随后的膀胱内化疗(进入膀胱腔)，如丝裂霉素c或卡介苗。对于肌肉浸润性膀胱癌，目前的治疗标准是基于顺铂的新辅助化疗，然后根治性膀胱切除术。一些证据表明，非肌肉侵袭性膀胱肿瘤和肌肉侵袭性膀胱肿瘤不同的临床结果可以归因于它们不同的分子谱例如，fgfr3的功能获得性突变在低级别非肌肉浸润性膀胱癌中更普遍，而tp53的缺失或突变在高级别肌肉浸润性膀胱癌中更常见。最近，一些研究表明，三维类器官培养系统对癌症生物学的各个方面建模的价值。特别是，从结直肠癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、膀胱癌和前列腺癌中提取的患者来源的类器官可以模拟亲本肿瘤的关键特征，也可以用于研究药物反应。

2、类器官是由多能干细胞或器官祖细胞分化，并自组装成有结构和功能的完整哺乳动物器官，类器官技术在研究广泛的对象方面潜力巨大，包括发育生物学、疾病病理学、细胞生物学、再生机制、精准医疗以及药物毒性和药效试验等。对于这些应用以及其他应用，类器官培养实现了对现有2d培养方法和动物模型系统的高信息量的互补，是二维培养和活体模型之间的重要桥梁，其较单层细胞培养模型更具生理学相关性，同时比活体模型更容易操纵监测信号通路和基因组编辑。类器官的价值在于它们能够自组织成最小的生物单位，表现出与原始组织相似的功能和复杂性。类器官的可操作性预示着类器官将为广泛的基础研究提供出色的模型系统，包括表达谱研究和体内难以获得的稀有细胞谱系的分析。

3、随着精准医疗领域的广泛应用，类器官成为临床前评估药物模型对患者带来了极大的价值，为提高肿瘤患者生存率，减少肿瘤患者痛苦表现出了显著的应用前景。目前临床主流的药物依然以化疗药物、靶点药物为主，临床上如何选择药物，如何针对患者指定精准的给药方案依然处于一个较为主观的评估阶段。类器官作为精准医疗领域最有前景的筛药模型之一，在为临床医生及患者提供一个快速、精准、客观的给药建议表现出了巨大潜力。但随着肿瘤治疗的发展，化疗药物在未来所占的权重会逐渐减小，靶点药物和免疫疗法的崛起，为临床肿瘤治疗提供了多样性，但由于免疫疗法的不稳定、副作用大等缺点越来越明显，如car-t对实体瘤作用稍微逊于白血病，nk的反应过大，毒副作用过强等，故用肿瘤类器官建立一个免疫疗法的临床前评估模型具有较大研究价值及社会意义。

4、因此，亟需一种共培养体系，在体外快速评估t细胞在体内对肿瘤的杀伤能力。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种膀胱癌类器官与t细胞共培养的培养基；本发明的目的之二在于提供利用所述培养基在体外快速评估t细胞对肿瘤杀伤力的方法。

2、为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、1、膀胱癌类器官与t细胞共培养的培养基，所述培养基系由膀胱癌类器官培养基、t细胞扩增培养基和基质胶；

4、所述膀胱癌类器官培养基包括dmem/f12，egf，fbs，y-27632，1×glutamax,primocin抗生素；

5、所述t细胞扩增培养基包括1640培养基、fbs、il-2、青霉素\链霉素双抗溶液、n-乙酰半胱氨酸、glutamax；

6、所述基质胶为matrigel。

7、本发明优选的，所述膀胱癌类器官培养基、t细胞扩增培养基、基质胶的体积比为45:45:10。

8、本发明优选的，所述t细胞扩增培养基各组分浓度如下：10％-20％fbs、il-210ng-200ng、n-乙酰半胱氨酸1-5nm、glutamax 1-5nm，其余为1640培养基；

9、所述膀胱癌类器官培养基各组分浓度如下：10-100ng/ml egf，5％-15％ fbs，10-100mm y-27632，1×glutamax，10-100mg/ml primocin，其余为dmem/f12培养基。

10、2、利用所述培养基在体外快速评估t细胞对肿瘤杀伤力的方法，包括如下步骤：

11、(1)取膀胱癌组织建立膀胱癌类器官；

12、(2)从外周血分离cd8+t细胞；

13、(3)将步骤(1)培养的膀胱癌类器官与步骤(2)分离的cd8+t细胞按照1：20的比例混合，然后加入所述培养基重悬并共培养，共培养24小时以上评估膀胱癌类器凋亡情况。

14、本发明优选的，所述步骤(1)为，取膀胱癌组织制备成单细胞悬液；然后加入3d培养基质胶重悬，然后接种于培养装置中，加入膀胱癌类器官培养基，再在培养箱中培养，每三天更换一次培养基，培养至14天。

15、本发明优选的，所述步骤(2)为，取外周血，采用ficoll提取外周血单个核细胞，然后采用cd3和cd28抗体激活t细胞，分选cd8+t细胞，然后扩增cd8+t细胞得到。

16、3、利用所述培养基筛选对肿瘤有疗效药物的方法，包括如下步骤：

17、(1)取膀胱癌组织建立膀胱癌类器官；

18、(2)从外周血分离cd8+t细胞；

19、(3)将步骤(1)培养的膀胱癌类器官与步骤(2)分离的cd8+t细胞按照1：20的比例混合，然后加入所述培养基重悬并共培养，培养过程中加入治疗药物，共培养24小时以上评估膀胱癌类器凋亡情况或颗粒酶b表达量。

20、本发明优选的，所述药物为anti-pd-1，或car-t疗法、nk疗法或tils疗法的药物。

21、本发明的有益效果在于：本发明公开了膀胱癌类器官与t细胞共培养的培养基及方法，本发明通过膀胱癌类器官与t细胞共培养的培养基，其中膀胱癌类器官的培养基能够快速培养出膀胱癌类器官，14天左右培养出满足共培养所需的大小在75-150μm的膀胱癌类器官，然后与t细胞在培养基条件下培养，用于在体外快速评估t细胞对肿瘤杀伤力和筛选治疗膀胱癌的药物。

技术特征：

1.膀胱癌类器官与t细胞共培养的培养基，其特征在于：所述培养基系由膀胱癌类器官培养基、t细胞扩增培养基和基质胶；

2.根据权利要求1所述膀胱癌类器官与t细胞共培养的培养基，其特征在于：所述膀胱癌类器官培养基、t细胞扩增培养基、基质胶的体积比为45:45:10。

3.根据权利要求1所述膀胱癌类器官与t细胞共培养的培养基，其特征在于：所述t细胞扩增培养基各组分浓度如下：10％-20％fbs、il-2 10ng-200ng、n-乙酰半胱氨酸1-5nm、glutamax 1-5nm，其余为1640培养基；

4.利用权利要求1～3任一项所述培养基在体外快速评估t细胞对肿瘤杀伤力的方法，其特征在于，包括如下步骤：

5.根据权利要求4所述利用所述培养基在体外快速评估t细胞对肿瘤杀伤力的方法，其特征在于：所述步骤(1)为，取膀胱癌组织制备成单细胞悬液；然后加入3d培养基质胶重悬，然后接种于培养装置中，加入膀胱癌类器官培养基，再在培养箱中培养，每三天更换一次培养基，培养至14天。

6.根据权利要求4所述利用所述培养基在体外快速评估t细胞对肿瘤杀伤力的方法，其特征在于：所述步骤(2)为，取外周血，采用ficoll提取外周血单个核细胞，然后采用cd3和cd28抗体激活t细胞，分选cd8+t细胞，然后扩增cd8+t细胞得到。

7.利用权利要求1～3任一项所述培养基筛选对肿瘤有疗效药物的方法，其特征在于：包括如下步骤：

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述药物为anti-pd-1，或car-t疗法、nk疗法或tils疗法的药物。

技术总结
本发明公开了膀胱癌类器官与T细胞共培养的培养基及方法，本发明通过膀胱癌类器官与T细胞共培养的培养基，其中膀胱癌类器官的培养基能够快速培养出膀胱癌类器官，14天左右培养出满足共培养所需的大小在75‑150μm的膀胱癌类器官，然后与T细胞在共培养的培养基条件下培养，用于在体外快速评估T细胞对肿瘤杀伤力和筛选治疗膀胱癌的药物。

技术研发人员：黄璘,聂盼,万源,刘海洋
受保护的技术使用者：重庆嘉士腾生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14