一种将iPSC从多能态向全能态转变的TBX3载体系统

本发明公开了一套可以将ipsc从多能态向全能态的转变的tbx3载体系统，属于生物。

背景技术：

1、全能态的干细胞具有参与全谱系发育特征，为解析早期胚胎发育以及培育遗传改良新品种以及建立培育人类器官移植的体系具有重要的意义。但是，目前报道的ipscs株普遍缺乏形成生殖系嵌合后代的潜能，也就是这些细胞株均处于未完全重编程的多能态。这些问题表明仅依赖于传统的oskm（oct4, sox2, klf4,c-myc）四个外源转录因子进行诱导重编程，获得的ipscs不具有全能态特征。建立一套将ipsc从多能态向全能态的转变的系统对后续的科学研究至关重要。

技术实现思路

1、一、名词定义

2、本专利所指tbx3（t-box transcription factor 3）是一种蛋白质，由tbx3编码。tbx3的表达起源于早起囊胚，主要定位于囊胚的内细胞团。 tbx3的纯和突变会导致小鼠的胚胎致死，在人上则表现为滋养层发育缺陷，进而影响胚胎的发育进程。

3、本专利所指多能态是指ipsc的一种多能性状态，这种状态的ipsc具有分化成多种但是有限的细胞种类的能力

4、本专利所指全能态指ipsc的一种全能性状态，这种状态的ipsc具有发育成机体任何一种细胞的能力。

5、二、构建在ipsc中过表达tbx3的载体系统

6、根据ncbi中公布的猪（xm 001928002.4）基因序列，设计特异性同源臂引物。将扩增得到的猪tbx3基因片段组装到pcdh-ef1-tbx3-t2a-puro骨架载体上

7、上游引物：caaggatgacgatgacaaggaattcagcctctccatgagagatccgg

8、下游引物：cttcctctgccctcggatcccggggatgtgctgcgggccctat

9、三、构建过表达tbx3的猪ipsc细胞株

10、根据本发明前期构建的tbx3过表达载体，我们构建了一株在传统的猪ipsc（oskm细胞株，在猪胎儿成纤维细胞中过表达oct4, sox2, klf4,c-myc诱导重编程而来的细胞株）中过表达tbx3的细胞株（oskmt细胞株）。

11、具体而言，利用293t细胞进行慢病毒包装，获得含有tbx3的毒液。将2*104多能态的猪ipsc接种于12孔细胞培养板中，贴壁12小时后将毒液与培养基1:1混合并加入0.1% 体积的polybrene进行病毒感染。12小时后更换新鲜培养基。细胞按照正常培养体系继续培养，待克隆长到合适大小，在培养基中添加1 μg/ml的嘌呤霉素。培养2周后，挑取状态良好的单细胞克隆。通过junction pcr的方法，检测这些单细胞克隆外源tbx3的表达情况，扩增出的条带做sanger测序。结果表明，挑取的细胞株表达外源导入的tbx3。

12、四、利用碱性磷酸酶试验验证了oskmt具有更高的多能性。

13、为了验证本发明的多能性更强，我们将前期得到的oskmt细胞株进行碱性磷酸酶染色。结果证明，oskmt细胞株呈现碱性磷酸酶更深的红色，说明其表现出更高的阳性特征。这一现象证明了oskmt细胞株的多能性要高于oskm细胞株。

14、五、利用类胚胎形成和分化试验验证了oskmt细胞株的分化功能。

15、为了验证本发明的分化功能更好，我们进行了类胚胎形成和分化试验。结果表明，在相同的培养体系中，oskmt细胞株形成类胚胎的数量显著的高于oskm细胞株。并且，诱导分化3天时，oskmt组部分类胚胎开始出现结构分层的现象，这一现象与猪早期胚胎有腔囊胚的出现颇为类似。伴随着培养时间的延长，出现有腔的结构体逐渐增多，至6天时，约有90%呈现出分层的特征，而oskm组的类胚胎均呈现为实体球型结构。预示着oskmt细胞组可能具有全谱系分化的现象。

16、六、利用胚胎嵌合试验证明oskmt细胞株具有发育成完整个体的功能。

17、为了验证oskmt细胞株可以发育为完整的个体。我们进行了8细胞期胚胎的嵌合试验，并将嵌合胚胎移植到受体母猪的子宫内。孕28天时，采集胎儿并进行检测。结果表明，oskmt细胞株嵌合胚胎发育得到的胎儿具有胎体与胎盘均为阳性的嵌合特征。

18、以上结果说明，通过tbx3载体系统得到的oskmt细胞株具有全能态。

19、七、本发明的优势。

20、1.本发明创新性强，目前人们所获得的猪多能干细胞普遍缺乏有效嵌合能力，极大的阻碍了猪发育生物学及干细胞育种等领域的研究进展。本发明中获得的oskmt细胞株，具有胚内与胚外谱系分化的全胚层发育能力，具有全能性特征。

21、2.本发明操作简单，本发明只需要将tbx3载体系统导入猪ipsc中即可得到全能态的细胞。

22、3.本发明具有广阔的应用前景。通过本发明获得的全能态的猪ipsc具有胚内与胚外谱系分化的全胚层发育能力。在干细胞育种，再生医学领域具有重要的研究与应用价值。

技术特征：

1.本发明提供了一种将猪ipsc从多能态向全能态转变的tbx3载体系统；其特征在于能够将猪ipsc从多能态转变为全能态。

2.如权利要求1所述的通过tbx3系统可以将猪ipsc从多能态转变为全能态，其特征如下：

3.通过tbx3的过表达，使猪ipsc从多能态转变为全能态。

技术总结
本发明公开了一套可以将iPSC从多能态向全能态转变的载体系统。从NCBI中提取猪，小鼠，大鼠，人和牛的TBX3的CDS序列进行进化树的分析。其中，猪与人的相似度达到了90%以上，而与小鼠的相似度在86%。这些结果表明，TBX3具有良好的序列保守性，为TBX3推进猪iPSC从多能态向全能态的转变提供了一定的基础。并通过碱性磷酸酶染色，类胚胎形成以及胚胎嵌合试验验证了在该载体系统的作用下猪iPSC的全能态。进而，本发明提供了猪iPSC从多能态向全能态转变的新的载体系统。本发明具有创新性强、安全性好、操作简便等特点。为后续猪iPSC多能态向全能态转变的机制研究提供了可靠的技术平台。

技术研发人员：华进联,沈巧艳,魏红江,李娜
受保护的技术使用者：西北农林科技大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13