一种基于高通量测序技术的INHα靶向纳米抗体及其应用

本发明属于纳米抗体，尤其涉及一种基于高通量测序技术的inhα靶向纳米抗体及其应用。

背景技术：

1、新疆天然牧草资源丰富，是我国重要的牧区之一，发展畜牧业有着得天独厚的条件。新疆绵羊存栏数在我国也名列前茅，且具有品种多、数量大、分布广的特点，是新疆农牧民收入的重要来源之一。然而新疆包括哈萨克羊和阿勒泰羊在内的大多数绵羊为季节性发情，且一般秋季配种，春季产羔，一年一产，这种繁育方式极大限制了绵羊年出栏量和牧民的经济收入。因此探究如何提高新疆绵羊排卵率和产羔数对新疆市场经济的发展和提高新疆农牧民收入均有促进作用。

2、抑制素(inhibin,inh)是下丘脑-垂体-性腺轴系统中影响动物生殖的一种异二聚体糖蛋白激素，参与了哺乳动物的排卵机制。众多研究结果已证实，抑制素免疫不仅可提高雌性哺乳动物的血清促卵泡素水平、排卵率和产胎率，还能提高雄性哺乳动物精子数和精子活性。抑制素被动免疫也可中和动物机体抑制素，进而提高动物繁殖力。目前为止，抑制素抗体的来源包括精清，卵泡液，血清，人工合成肽，基因工程产物。抗体种类包括多克隆抗体和单克隆抗体。免疫动物包括绵羊、山羊、牛、马、兔、猪等。现有研究表明抑制素α亚基基因(inhibinα,inhα)是一个负调控动物卵泡生长发育的主效基因，并且该基因功能可能在不同物种之间具有保守性。这对于以inhα为靶基因进行家畜分子突变育种或通过其基因表达产物的主动、被动免疫途径提高绵羊繁殖效率，提供了可能性。目前，有关用抑制素免疫提高牛羊繁殖力的研究较多。其结论基本上是一致的，即抑制素免疫可部分提高动物的繁殖力。但是由于单纯的抑制素蛋白制备或抑制素单克隆抗体制备比较困难、制备工艺复杂成本高、使用也极不方便等客观原因，致使该项技术难以在生产上得到广泛的应用。因此，探索研究制备抑制素免疫制剂的新方法和新的免疫策略已成为抑制素免疫繁殖技术的研究热点。本领域亟需提供一种能够解决当前抑制素免疫制剂因免疫原性低、稳定性弱、可溶性差、不易表达等缺点导致的无法推广使用问题的技术方案，为最终获得经济高效的绵羊抑制素免疫抑制剂奠定基础。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种靶向inhα的纳米抗体，能够用于制备抑制素免疫抑制剂，解决当前抑制素免疫制剂因免疫原性低、稳定性弱、可溶性差、不易表达等缺点导致的无法推广使用的问题。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

3、本发明提供了一种靶向inhα的纳米抗体，所述纳米抗体为nb-1737、nb-1971和nb-2004中的至少一种；所述nb-1737、nb-1971和nb-2004的氨基酸序列分别如seq id no.1-seq id no.3所示。

4、本发明还提供了一种编码上述纳米抗体的基因，编码nb-1737、nb-1971和nb-2004纳米抗体的基因的核苷酸序列分别如seq id no.4-seq id no.6所示。

5、本发明还提供了一种能够表达上述基因的表达载体。

6、优选的，所述表达载体为pet-32a。

7、本发明还提供了一种含有上述表达载体的宿主细胞。

8、优选的，所述宿主细胞为大肠杆菌bl21(de3)。

9、本发明还提供了一种上述纳米抗体或上述基因或上述表达载体或上述宿主细胞在制备抗卵泡抑制素免疫制剂中的应用。

10、本发明还提供了一种上述纳米抗体或上述基因或上述表达载体或上述宿主细胞在提高动物产胎率中的应用。

11、优选的，所述动物包括绵羊。

12、本发明的有益效果：

13、本发明首先通过对inhα蛋白免疫后双峰驼淋巴细胞中克隆出的总vhh基因进行高通量测序，以及对血清中筛选出的抗inhα抗体进行质谱分析，筛选出inhα特异性纳米抗体基因。然后通过基因合成、载体构建和蛋白表达得到inhα特异性纳米抗体蛋白。最后通过蛋白-蛋白模拟对接、间接elisa亲和力测定和小鼠被动免疫试验初步鉴定筛选出的纳米抗体与inhα的亲和力和生物学功能。为抑制素被动免疫抗体的制备提供新的思路，为最终获得经济高效的绵羊抑制素纳米抗体奠定基础，同时为动物繁殖免疫学提供理论支持。

14、本发明提供的3株inhα特异性纳米抗体，均与inhα蛋白具有较好的亲和性，且被动免疫均可促进小鼠的卵泡生成，产仔率提高和睾丸发育。此外，纳米抗体nb-1737、nb-1971和nb-2004被动免疫可抑制inha基因表达水平，促进fshb基因的表达水平。表明本发明纳米抗体能够用于制备抑制素免疫抑制剂，有助于解决当前抑制素免疫制剂因免疫原性低、稳定性弱、可溶性差、不易表达等缺点导致的无法推广使用的问题。

15、本发明纳米抗体比起传统抗体具有分子量小、降解抗性及稳定性好、可利用原核生物表达，规模化生产成本低、产品表征容易、翻译后修饰低，均一性好和组织穿透性好，容易吸收的优点。

技术特征：

1.一种靶向inhα的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体为nb-1737、nb-1971和nb-2004中的至少一种；所述nb-1737、nb-1971和nb-2004的氨基酸序列分别如seq id no.1-seq id no.3所示。

2.一种编码权利要求1所述纳米抗体的基因，其特征在于，编码nb-1737、nb-1971和nb-2004纳米抗体的基因的核苷酸序列分别如seq id no.4-seq id no.6所示。

3.一种能够表达权利要求2所述基因的表达载体。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为pet-32a。

5.一种含有权利要求3或4所述表达载体的宿主细胞。

6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌bl21(de3)。

7.权利要求1所述纳米抗体或权利要求2所述基因或权利要求3-4任意一项所述表达载体或权利要求5-6任意一项所述宿主细胞在制备抗卵泡抑制素免疫制剂中的应用。

8.权利要求1所述纳米抗体或权利要求2所述基因或权利要求3-4任意一项所述表达载体或权利要求5-6任意一项所述宿主细胞在提高动物产胎率中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述动物包括绵羊。

技术总结
本发明提供了一种基于高通量测序技术的INHα靶向纳米抗体及其应用，属于纳米抗体技术领域。本发明提供的3株INHα特异性纳米抗体，均与INHα蛋白具有较好的亲和性，且被动免疫均可促进小鼠的卵泡生成，产仔率提高和睾丸发育。此外，纳米抗体Nb‑1737、Nb‑1971和Nb‑2004被动免疫可抑制INHA基因表达水平，促进Fshb基因的表达水平。表明本发明纳米抗体能够用于制备抑制素免疫抑制剂，有助于解决当前抑制素免疫制剂因免疫原性低、稳定性弱、可溶性差、不易表达等缺点导致的无法推广使用的问题。

技术研发人员：吾热力哈孜·哈孜汗,巴合提·博代,马继福,米拉古丽·加尔恒,沙拉玛提·波代
受保护的技术使用者：石河子大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15