鼠李糖基转移酶突变体、编码基因、制备方法及应用

本发明涉及生物合成，尤其涉及一种鼠李糖基转移酶突变体、编码基因、制备方法及应用。

背景技术：

1、天然产物糖基化修饰的种类多样，其中，鼠李糖基化修饰是很重要的一种，且取代形式多样。鼠李糖基化修饰能显著提高天然产物的水溶性及稳定性，改善一些其生物活性，增加其生物利用度，增强靶向性作用并减少毒副作用等。因此，结构多样的鼠李糖苷类化合物在调节植物生长和发育方面发挥着不可替代的作用，且是药用活性先导物的重要来源。

2、鼠李糖基化修饰是由鼠李糖基转移酶催化完成的，鼠李糖基转移酶的活性是制约鼠李糖基化天然产物产量的重要因素。提高鼠李糖基转移酶酶活的蛋白质工程方法有两种，包括体外定向进化和理性设计。其中定向进化可以人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制，在体外改造基因，定向选择出所需性质的突变酶。上海交通大学冯雁课题组通过定向进化糖基转移酶ugt51，使其活性提高了近1500倍。中国科学院天津工业生物技术研究所孙媛霞团队通过定向进化使糖基转移酶ugt74ac1的活性提高了40000多倍。目前对于鼠李糖基转移酶的定向进化还未见报道。

3、新橙皮苷是具有鼠李糖基修饰的黄酮类化合物，主要从中药枳实中提取，具有抗氧化、抗菌消炎、抗肿瘤等生物活性；同时，新橙皮苷经氢化而得的新橙皮苷二氢查耳酮，甜度是蔗糖的1500-2000倍，且适口性好、热量小、无毒害，被广泛用于果汁、果酒、饮料、糕点及药剂配方的甜味剂（矫味剂），特别适合作为糖尿病患者的食品；因此新橙皮苷的市场需求量巨大。然而，新橙皮苷植物含量低，提取费时费力，由于其结构复杂，化学全合成新橙皮苷还难以实现，因此新橙皮苷的价格昂贵。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种鼠李糖基转移酶突变体、编码基因、制备方法及应用。本发明所述鼠李糖基转移酶突变体的酶活数据kcat/km是对照菌酶活的136倍，相对于现有技术具有显著进步。

2、本发明提供了一种鼠李糖基转移酶突变体，所述鼠李糖基转移酶突变体的氨基酸序列包括seq id no:4。

3、本发明提供了所述鼠李糖基转移酶突变体的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列包括seq id no:3。

4、本发明提供了用于获得所述编码基因的定点突变引物对，所述定点突变引物对包括q49a突变引物对和/或s50a突变引物对；

5、所述q49a突变引物对的上游引物序列包括seq id no:13；

6、所述q49a突变引物对的下游引物序列包括seq id no:14；

7、所述s50a突变引物对的上游引物序列包括seq id no:15；

8、所述s50a突变引物对的下游引物序列包括seq id no:16。

9、本发明提供了用于生产所述鼠李糖基转移酶突变体的生物材料，所述生物材料为重组质粒和/或工程菌，所述生物材料包括所述编码基因。

10、优选的，所述生物材料还包括udp-鼠李糖合酶基因。

11、优选的，所述udp-鼠李糖合酶基因的核苷酸序列包括seq id no:6。

12、本发明提供了所述鼠李糖基转移酶突变体的制备方法，包括如下步骤：

13、s1、构建所述生物材料，所述生物材料为工程菌；

14、s2、培养步骤s1构建得到的工程菌，得到含有鼠李糖基转移酶突变体的培养液，分离培养液成分，得到所述鼠李糖基转移酶突变体的纯化蛋白。

15、优选的，步骤s1所述工程菌的宿主菌包括大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌和丝状真菌中的任意一种或者多种。

16、本发明提供了所述鼠李糖基转移酶突变体、所述编码基因、所述引物对、所述生物材料、所述制备方法制备得到的鼠李糖基转移酶突变体在生产新橙皮苷中的应用，所述应用包括鼠李糖基转移酶突变体在体外催化体系中催化合成新橙皮苷的步骤；所述体外催化体系包括鼠李糖基转移酶突变体的纯化蛋白、udp-鼠李糖和橙皮素-7-o-葡萄糖苷。

17、优选的，所述催化合成的反应ph值为7.5-8.5，反应温度为36.5-37.5℃。

18、本发明还提供了所述生物材料在生产新橙皮苷中的应用，所述生物材料为工程菌；所述应用包括工程菌发酵的步骤；所述工程菌发酵的底物包括橙皮素-7-o-葡萄糖苷；所述工程菌发酵的温度为25~35℃；所述工程菌发酵的时间为3-15天。

19、有益效果

20、本发明提供了一种鼠李糖基转移酶突变体、编码基因、制备方法及应用。所述鼠李糖基转移酶突变体的酶活数据kcat/km是对照菌酶活的136倍，相对于现有技术具有显著进步。将本发明所述鼠李糖基转移酶突变体应用于新橙皮苷的制备，可显著提升反应底物的鼠李糖基修饰效率，进而提升新橙皮苷的生产效率。

21、本发明还提供了用于生产所述鼠李糖基转移酶突变体的重组质粒及工程菌；尤其包括具有稳定遗传的鼠李糖基转移酶突变体与udp-鼠李糖合酶基因共表达工程菌株，在只添加底物橙皮素-7-o-葡萄糖苷，不添加udp-鼠李糖的前提下，实现了新橙皮苷的高效生产，为新橙皮苷的量产提供了有效策略。

技术特征：

1.鼠李糖基转移酶突变体，其特征在于，所述鼠李糖基转移酶突变体的氨基酸序列包括seq id no:4。

2.权利要求1所述鼠李糖基转移酶突变体的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列包括seq id no:3。

3.用于获得权利要求2所述编码基因的定点突变引物对，其特征在于，所述定点突变引物对包括q49a突变引物对和/或s50a突变引物对；

4.用于生产权利要求1所述鼠李糖基转移酶突变体的生物材料，其特征在于，所述生物材料为重组质粒和/或工程菌，所述生物材料包括权利要求2所述编码基因。

5.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料还包括udp-鼠李糖合酶基因。

6.根据权利要求5所述的生物材料，其特征在于，所述udp-鼠李糖合酶基因的核苷酸序列包括seq id no:6。

7.权利要求1所述鼠李糖基转移酶突变体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

8.权利要求1所述鼠李糖基转移酶突变体、权利要求2所述编码基因、权利要求3所述引物对、权利要求4-6任意一项所述生物材料或者权利要求7所述制备方法制备得到的鼠李糖基转移酶突变体在生产新橙皮苷中的应用，其特征在于，所述应用包括鼠李糖基转移酶突变体在体外催化体系中催化合成新橙皮苷的步骤；所述体外催化体系包括鼠李糖基转移酶突变体的纯化蛋白、udp-鼠李糖和橙皮素-7-o-葡萄糖苷。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述催化合成的反应ph值为7.5-8.5，反应温度为36.5-37.5℃。

10.权利要求5或者权利要求6所述生物材料在生产新橙皮苷中的应用，其特征在于，所述生物材料为工程菌；所述应用包括工程菌发酵的步骤；所述工程菌发酵的底物包括橙皮素-7-o-葡萄糖苷；所述工程菌发酵的温度为25~35℃；所述工程菌发酵的时间为3-15天。

技术总结
本发明涉及一种鼠李糖基转移酶突变体、编码基因、制备方法及应用。所述鼠李糖基转移酶突变体的酶活数据Kcat/km是对照菌酶活的136倍，相对于现有技术具有显著进步。将本发明所述鼠李糖基转移酶突变体应用于新橙皮苷的制备，可显著提升反应底物的鼠李糖基修饰效率，进而提升新橙皮苷的生产效率。本发明还提供了用于生产所述鼠李糖基转移酶突变体的重组质粒及工程菌；尤其包括具有稳定遗传的鼠李糖基转移酶突变体与UDP‑鼠李糖合酶基因共表达工程菌株，在只添加底物橙皮素‑7‑O‑葡萄糖苷，不添加UDP‑鼠李糖的前提下，实现了新橙皮苷的高效生产，为新橙皮苷的量产提供了有效策略。

技术研发人员：王彩霞,薛强,郝学密,于宛彤,苏新堯
受保护的技术使用者：中国中医科学院中药研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13