一种基于血浆外泌体微小RNA组合的肺结节良恶性早期筛查的试剂盒

本发明属于基因，具体涉及一种基于血浆外泌体微小rna组合的肺结节良恶性早期筛查的试剂盒。

背景技术：

1、肺癌是包括中国在内的世界上癌症相关死亡的主要原因。造成肺癌高死亡率的重要原因之一是早期缺乏特定的临床症状，大多数患者在首次诊断时已处于疾病晚期，0期肺癌术后5年生存率可达90％，ia期降低到60％左右，晚期肺癌仅为17％左右。因此，肺癌的早期诊断对提高肺癌的整体生存率具有重要意义。

2、肺癌发生的最初阶段，患者可能没有临床症状，ct等检查也无影像学改变。随着肺癌的进展，肿瘤增大到一定程度后，ct等影像学检查能观察到直径小于3.0cm的类圆形或者形状不规则的密度增高影的阴影，即肺结节。但是肺结节不是早期肺癌的独特表现，90％以上肺结节是良性病变。目前临床上对肺癌的风险预测是以肺结节的大小、特征、位置等ct征象为基础，结合患者年龄、吸烟史等临床资料，建立的数学模型。常用的有梅奥临床肺癌预测模型、gould创建的va肺癌风险预测模型、以及mcwilliams等开发的pan can模型，但这些模型的受试者工作特征曲线下面积(area under the curve，auc)分别为0.902、0.735和0.895，表明特异度和灵敏度不够高，而且这些模型预测是以肺结节大小、特征、位置等为基础，对于无肺结节的风险人群无法进行预测。

3、微小rna(mirna)是一种广泛存在于动物、植物和一些病毒中的非编码短链rna，通过诱导、调控基因的转录、翻译而参与机体的各项病理生理过程。微小rna最初产生于一个primary microrna转录本，然后在核糖核酸酶的作用下在细胞核内形成由70个核苷酸组成的pre-microrna，在rna-gtp和exportin5的协助下转运到胞质中并经过加工最终形成一个成熟的mirna分子。

4、外泌体作为细胞及体液中广泛存在的、具有脂质双层膜结构的一种囊泡小体，直径一般在40-100nm之间，多泡小体。外泌体中含有多种生物活性分子，包括蛋白质，核酸(微小rna等非编码rna、dna)，脂质等。外泌体双层膜结构可以保证其内容物的相对稳定，可以将其内容为传递给其他细胞以改变其功能，在许多病理和生理过程中起着重要作用。外泌体mirna在在肿瘤血管生成、肿瘤转移和免疫失衡中起着多效应的生物学作用，临床应用研究表明外泌体mirna可作为早期癌症检测的生物标志物。

5、由于血浆/血清外泌体mirna具有肿瘤的组织学特征，并且在血液中相对稳定，越来越多的研究表明血浆/血清外泌体mirna可以作为肿瘤诊断、预后和疗效判断等的生物标志物。近年来超过1000的研究探讨血浆/血清外泌体mirna作为肺癌早期诊断的标志物，但绝大多数筛选出来的mirna及其组合的诊断特异性和灵敏度在80％左右，与传统的影像学检查相比，没有显著改善。除了肺癌致病因素的多样性外，一个重要的原因是这些研究中采用加入异种mirna作为内部参照物，得到是待检测的mirna的相对定量结果。这既不符合临床检测的绝对定量要求，也可能影响了mirna在肺癌早期诊断的特异性和灵敏度。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种基于血浆外泌体微小rna组合的肺结节良恶性早期筛查的试剂盒。

2、为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种基于血浆外泌体微小rna组合的肺结节良恶性早期筛查的试剂盒，包括mir-1-3p+mir-99a-5p+mir-125b-5p和mir-1-3p+mir-99a-5p+mir-218-5p；mir-1-3p的序列为5’-uggaauguaaagaaguauguau-3’、mir-99a-5p的序列为5’-uggaauguaaagaaguauguau-3’、mir-125b-5p的序列为5’-ucccugagacccuaacuuguga-3’、mir-218-5p的序列为5’-uugugcuugaucuaaccaugu-3’。

3、优选的技术方案为：还包括：5×mmlv rt buffer和mirna rt primers。

4、优选的技术方案为：包括逆转录引物如下：

5、

6、优选的技术方案为：包括pcr引物如下：

7、

8、由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：

9、本发明在包含48例早期肺癌、29例良性肺结节和14例健康人的训练组中，其灵敏度和特异度均达到了100％；在包含74例早期肺癌、21例良性肺结节和25例健康人的训练组中，对早期肺癌的阳性预测率分别为97.3％和98.6％，而阴性预测率均达到100％。另一个优点在于极其灵敏的检测方法，可以检测飞克水平摩尔的血浆mirna(1fm＝10-15m)。

技术特征：

1.一种基于血浆外泌体微小rna组合的肺结节良恶性早期筛查的试剂盒，其特征在于：包括mir-1-3p+mir-99a-5p+mir-125b-5p和mir-1-3p+mir-99a-5p+mir-218-5p；mir-1-3p的序列为5’-uggaauguaaagaaguauguau-3’、mir-99a-5p的序列为5’-uggaauguaaagaaguauguau-3’、mir-125b-5p的序列为5’-ucccugagacccuaacuuguga-3’、mir-218-5p的序列为5’-uugugcuugaucuaaccaugu-3’。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：还包括：5×mmlv rt buffer和mirna rtprimers。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：包括逆转录引物如下：

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：包括pcr引物如下：

技术总结
一种基于血浆外泌体微小RNA组合的肺结节良恶性早期筛查的试剂盒，包括miR‑1‑3p+miR‑99a‑5p+miR‑125b‑5p和miR‑1‑3p+miR‑99a‑5p+miR‑218‑5p；miR‑1‑3p的序列为5’‑uggaauguaaagaaguauguau‑3’、miR‑99a‑5p的序列为5’‑uggaauguaaagaaguauguau‑3’、miR‑125b‑5p的序列为5’‑ucccugagacccuaacuuguga‑3’、miR‑218‑5p的序列为5’‑uugugcuugaucuaaccaugu‑3’。本发明可以检测飞克水平摩尔的血浆miRNA，且灵敏度高。

技术研发人员：赵大海,刘鹏程,刘辉,陶瑞,叶静,徐结苟
受保护的技术使用者：安徽医科大学第二附属医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15