一种片状载体培养人二倍体细胞有效传代的方法

本发明涉及细胞培养，尤其涉及一种片状载体培养人二倍体细胞有效传代的方法。

背景技术：

1、近年来，随着市场对疫苗和治疗性蛋白类生物制品的需求量增加及产品质量的严格要求，大规模细胞培养技术的应用凸显其安全性、经济性、有效性。哺乳动物细胞一直被用作生产治疗性蛋白的载体，在生物医药行业中已经得到广泛的应用。

2、人二倍体细胞在病毒学、细胞学、遗传学、肿瘤学等方面的研究中被广泛应用，特别是在病毒疫苗的制备中，作为一株比较理想的细胞基质备受重视。自1961年建立人二倍体细胞w1-38并运用于狂犬疫苗的制备以来，具有良好的免疫原性和安全性得到迅速发展，之后陆续建立多株人胚胎二倍体细胞株为公共事业做出巨大的贡献。我所于1973年取材于4月龄胚胎的肺组织建立的kmb-17细胞株，其生物学性质与w1-38和mrc-5接近，多倍体及结构异常的概率较低，无外源因子、无潜在致癌性、并且对多种病毒敏感。作为疫苗细胞基质，达到国际规定的条件，目前kmb-17已用于生产甲型肝炎减毒活疫苗、脊髓灰质炎减毒活疫苗、肠道病毒71型灭活疫苗。

3、为增加细胞产量、降低成本，生产更安全有效的蛋白制品，大规模细胞培养的开发和建立至关重要。kmb-17作为一株贴壁依赖型且生长缓慢的细胞系，故利用固定床生物反应器，片状载体作为贴壁介质提供了细胞最佳的培养条件，可建立合适的大规模培养体系，实现细胞高密度培养和产物高效表达。生物反应器培养人二倍体细胞的工艺优化和放大培养是疫苗规模化生产中的难点，人二倍体细胞对培养条件苛刻，增殖缓慢，消化过程中对ph、温度、胰酶浓度、胰酶作用时间、剪切力等比较敏感。

4、因此，摸索合适的胰酶浓度和胰酶作用时间，将细胞从片状载体上消化并放大至下一级反应器中培养，放大过程中有效的培养方法和消化方法提高细胞活力、细胞回收率、细胞增殖效果是放大培养的关键技术，目前尚未有文献报道。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了解决固定床生物反应器片状载体培养人二倍体细胞的消化传代方法中胰酶浓度、胰酶作用时间的问题，提供一种人二倍体细胞利用固定床生物反应器片状载体放大培养的一种有效的传代方法，该方法能增加细胞产量，降低成本，可广泛应用于疫苗规模化生产。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种片状载体培养人二倍体细胞有效传代的方法，包括如下步骤：

4、(1)将人二倍体细胞接种至第一生物反应器中培养，待细胞生长至平台期，用胰酶消化；

5、(2)将步骤(1)消化后的人二倍体细胞接种至第二生物反应器培养，待细胞生长至平台期再次使用胰酶消化；

6、(3)将步骤(2)消化的人二倍体细胞接种至第三生物反应器培养；

7、所述步骤(1)和(2)中胰酶的使用浓度为0.25％；所述胰酶消化的时间为10～20min。

8、优选的，步骤(1)所述接种密度为12～18×104个/ml。

9、优选的，步骤(2)所述接种密度为18～22×104个/ml。

10、优选的，步骤(3)所述接种密度为20～25×104个/ml。

11、优选的，步骤(1)～(3)所述培养的ph为7.0～7.4，溶氧为30～70％，转速为40～50rpm，温度为36.5～37.5℃。

12、优选的，所述人二倍体细胞为kmb-17细胞。

13、优选的，所述胰酶消化的ph为8.0～8.4。

14、优选的，所述胰酶消化的温度为35～38℃。

15、优选的，步骤(1)所述第一级生物反应器的工作体积范围为3～7l；

16、步骤(2)所述第二级生物反应器的工作体积范围为13～17l；

17、步骤(3)所述第三级生物反应器的工作体积范围为40～60l。

18、细胞的接种密度是按反应器总体积算的，比如第一级反应器消化得到细胞密度50×104个/ml，10l体积，总细胞量50×104×10×103，下一级反应器的培养体积为15l，那15l中的细胞密度为50×104×15×103。

19、与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

20、1、本发明提供的方法能提高传代细胞的活力、细胞回收率、细胞的增殖效果，可广泛应用于疫苗规模化生产，而现有技术中，并不能达到本发明的培养规模。

21、2、本发明方法可有效提高细胞的增殖率，传代时间短，可在短时间内培养得到大量的人二倍体细胞，明显优于现有技术的方法。

技术特征：

1.一种片状载体培养人二倍体细胞有效传代的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种片状载体培养人二倍体细胞有效传代的方法，其特征在于，步骤(1)所述接种密度为12～18×104个/ml。

3.根据权利要求1所述的一种片状载体培养人二倍体细胞有效传代的方法，其特征在于，步骤(2)所述接种密度为18～22×104个/ml。

4.根据权利要求1所述的一种片状载体培养人二倍体细胞有效传代的方法，其特征在于，步骤(3)所述接种密度为20～25×104个/ml。

5.根据权利要求1所述的一种片状载体培养人二倍体细胞有效传代的方法，其特征在于，步骤(1)～(3)所述培养的ph为7.0～7.4，溶氧为30～70％，转速为40～50rpm，温度为36.5～37.5℃。

6.根据权利要求1所述的一种片状载体培养人二倍体细胞有效传代的方法，其特征在于，所述人二倍体细胞为kmb-17细胞。

7.根据权利要求1所述的一种片状载培养人二倍体细胞有效传代的方法，其特征在于，所述胰酶消化的ph为8.0～8.4。

8.根据权利要求1所述的一种片状载体培养人二倍体细胞有效传代的方法，其特征在于，所述胰酶消化的温度为35～38℃。

9.根据权利要求1所述的一种片状载体培养人二倍体细胞有效传代的方法，其特征在于，步骤(1)所述第一级生物反应器的工作体积范围为3～7l；

技术总结
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种片状载体培养人二倍体细胞有效传代的方法。本发明提供了一种片状载体培养人二倍体细胞有效传代的方法，包括如下步骤：(1)将人二倍体细胞接种至第一级生物反应器中培养，待细胞生长至平台期，用胰酶消化；(2)将步骤(1)消化后的人二倍体细胞接种至第二级生物反应器培养，待细胞生长至平台期再次使用胰酶消化；(3)将步骤(2)消化的人二倍体细胞接种至第三级生物反应器培养。本发明方法逐级放大培养人二倍体细胞，提高细胞产量，降低成本，可广泛应用于疫苗规模化生产。

技术研发人员：杨净思,平玲,沈武玲,顾朝剑,李宏森
受保护的技术使用者：中国医学科学院医学生物学研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14