小菜蛾神经肽F受体基因和dsRNA及其应用

本发明属于分子生物学，具体为小菜蛾神经肽f受体基因和dsrna及其应用。

背景技术：

1、小菜蛾(plutela xylostela)属节肢动物门昆虫纲鳞翅目菜蛾科，是一种主要危害十字花科蔬菜的完全变态昆虫。自从20世纪70年代以来，由于其分布范围广、适应能力强、繁殖速度快，造成大规模爆发。防治小菜蛾的主要措施有生物、化学、物理和农业措施。目前，小菜蛾已经对拟除虫菊酯类、有机磷类、氨基甲酸酯类、有机氯类、苯甲酰基脲类、沙蚕毒素类、昆虫生长调节剂以及微生物源杀虫剂等均产生不同程度的抗药性，几乎涉及到应用于小菜蛾防治的所有药剂。综合治理形势十分严峻，基于新型作用机制的防治策略研究变得尤为重要。昆虫体内分布广泛且高度保守的神经肽及其受体参与调节昆虫众多生理行为及过程，使得神经肽及其受体被认为是害虫控制的重要潜在生物靶点。研究发现神经肽f(neuropeptide f，npf)及其受体(neuropeptide f receptor，npfr)在多种昆虫中参与调节取食、繁殖、学习、运动等生理功能，但在小菜蛾中关于神经肽f及其受体的研究较少。

2、由于rnai对靶标基因沉默的特异性和高效性，被广泛用于分析鳞翅目昆虫的基因功能，为鳞翅目昆虫生长发育、分子调控机制及生物学研究奠定基础。dsrna导入靶标昆虫的方式较多，其中显微注射法和饲喂法在小菜蛾中应用较为广泛。ellango等人将dsrna通过饲喂的给予小菜蛾，沉默靶基因酪氨酸羟化酶(th)，th转录及幼虫取食水平降低，并引起幼虫死亡，表明th基因具有作为rnai介导的小菜蛾管理的靶基因的潜力。israni等人将htii5菌株表达的dsrna涂抹在叶片表面饲喂小菜蛾及棉铃虫，干扰蜕皮激素受体、昆虫肠粘蛋白和丝氨酸蛋白酶基因，靶标基因转录显著减少，幼虫伴有各种蜕皮异常、整体发育延迟，且大量死亡，成虫生殖潜力显著下降，产卵量、卵孵化率下降。针对体型较小的小菜蛾，通过饲喂法沉默靶标基因相较于显微注射法、浸泡法等更简单且具吸引力。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种防治小菜蛾的方法。本发明通过神经肽f受体基因及dsrna在防治小菜蛾中的应用，该dsrna可以抑制小菜蛾小菜蛾取食、体重增长，影响其生长发育，从而达到控制害虫的目的。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、在第一方面，本发明提供了小菜蛾神经肽f受体基因，该基因具有seq id no.1所示的序列。

4、在第二方面，本发明提供了小菜蛾神经肽f受体基因的用途，用于防治小菜蛾。

5、在第三方面，本发明提供了一种靶向小菜蛾神经肽f受体基因表达的dsrna，其中所述小菜蛾神经肽f受体基因具有seq id no.1所示的序列。

6、在第四方面，本发明提供了一种靶向小菜蛾神经肽f受体基因表达的dsrna的制备方法，所述方法包括以具有seq id no.1所示的序列为模板，使用引物扩增出正义链和反义链，转录退火后形成dsrna。

7、优选地，在所述方法中，所述引物包括：inpfr-f：taatacgactcactatagggatgcccttttatgatcaaatgagggt；inpfr-r：taatacgactcactatagggtcagaaaatttgcgagcattgagaggt；npfr-f：atgcccttttatgatcaaatgag ggt；npfr-r：tcagaaaatttgcgagcattgagaggt。

8、在第五方面，本发明提供了一种防治小菜蛾的方法，所述方法包括使小菜蛾幼虫与抑制小菜蛾神经肽f受体基因表达的物质接触。

9、优选地，所述抑制小菜蛾神经肽f受体基因表达的物质是靶向小菜蛾神经肽f受体基因表达的dsrna。

10、优选地，所述接触包括使小菜蛾幼虫摄氏抑制小菜蛾神经肽f受体基因表达的物质。

11、在第六方面，本发明提供了一种用于防治小菜蛾的药剂，所述药剂包含靶向小菜蛾神经肽f受体基因表达的dsrna。

12、与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明采用饲喂法将dsrna递送至小菜蛾体内可以有效沉默靶标基因神经肽f受体。持续沉默npfr基因后，实验组幼虫发育延缓、形态较小，体重与对照组呈显著差异；给予dsnpfr 12h后正常饲喂小菜蛾3龄幼虫直至化蛹，取食量高于对照组，且化蛹时间推迟约24h。npfr基因沉默后，通过调控小菜蛾的摄食行为，从而抑制小菜蛾的体重增长，发育延缓，推迟化蛹时间，影响其生长发育，为绿色害虫防治提供了新思路。

技术特征：

1.小菜蛾神经肽f受体基因，其特征在于，具有seq id no.1所示的序列。

2.小菜蛾神经肽f受体基因的用途，其特征在于，用于防治小菜蛾。

3. 一种靶向小菜蛾神经肽f受体基因表达的dsrna，其特征在于，所述小菜蛾神经肽f受体基因具有seq id no.1所示的序列。

4. 一种靶向小菜蛾神经肽f受体基因表达的dsrna的制备方法，其特征在于，所述方法包括以具有seq id no.1所示的序列为模板，使用引物扩增出正义链和反义链，转录退火后形成dsrna。

5.如权利要求4所述的靶向小菜蛾神经肽f受体基因表达的dsrna的制备方法，其特征在于，所述引物包括：inpfr-f：taatacgactcactatagggatgcccttttatgatcaaatgagggt；inpfr-r：taatacgactcactatagggtcagaaaatttgcgagcattgagaggt；npfr-f：atgcccttttatgatcaaatgagggt；npfr-r：tcagaaaatttgcgagcattgagaggt。

6.一种防治小菜蛾的方法，其特征在于，所述方法包括使小菜蛾幼虫与抑制小菜蛾神经肽f受体基因表达的物质接触。

7.如权利要求6所述的防治小菜蛾的方法，其特征在于，所述抑制小菜蛾神经肽f受体基因表达的物质是靶向小菜蛾神经肽f受体基因表达的dsrna。

8.如权利要求6所述的防治小菜蛾的方法，其特征在于，所述接触包括使小菜蛾幼虫摄氏抑制小菜蛾神经肽f受体基因表达的物质。

9.一种用于防治小菜蛾的药剂，其特征在于，所述药剂包含靶向小菜蛾神经肽f受体基因表达的dsrna。

技术总结
本发明提供了小菜蛾神经肽F受体基因和dsRNA及其应用。本发明方法可以通过RNAi抑制小菜蛾神经肽F受体基因的表达，进而抑制小菜蛾小菜蛾取食、体重增长，影响其生长发育，从而达到控制害虫的目的，具有极高的特异性和高效性，为绿色害虫防治提供了新思路。

技术研发人员：刘贤金,吴佳奕,朱庆
受保护的技术使用者：江苏大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13