猪TRIM56敲除质粒、细胞系及其构建方法和应用

本发明属于分子生物学，更具体地，涉及猪trim56敲除质粒、细胞系及其构建方法和应用。

背景技术：

1、trim56，属于三基序蛋白(tripartite motif,trim)家族的c-v子家族，n端含有ring、b-box和超螺旋结构(coiled-coil)3个保守的结构域，但其c-末端结构尚不十分清楚。猪trim56蛋白由755个氨基酸组成。trim56具有环依赖的e3泛素连接酶活性和细胞中的自结合，具有介导泛素向异种底物和自身转移的能力。trim56能够激活tlr3介导的抗病毒信号通路，trim56可抑制i型人类免疫缺陷病毒、牛病毒性腹泻病毒、冠状病毒等的增殖。trim56的抗病毒活性取决于其e3连接酶的活性及其c末端区域的完整性。

2、猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndromevirus,prrsv)属于动脉炎病毒科(arteriviridae)动脉炎病毒属(arterivirus)，有囊膜的单股正链rna病毒。prrsv感染猪体后能够引发猪繁殖与呼吸综合征(porcinereproductive and respiratory syndrome,prrs)，是一种高度传染性疾病。其特征表现为妊娠母猪流产、死胎和产木乃伊胎，仔猪呼吸障碍，并且能破坏猪的免疫系统，引起混合感染或继发感染。prrsv自爆发以来，对全球的养猪业都造成了严重的经济损失，世界动物卫生组织(oie)将其归类为b类传染病。目前，我国主要采用弱毒活疫苗免疫接种来防治prrs，但在生产工艺等方面亟待改善和提高，探究促进prrsv增殖的细胞工具能够为该病的防控提供新的思路和方法。

3、猪trim56(strim56)是否抑制prrsv复制和增殖，未见任何相关研究报道。crispr/cas9基因编辑技术由cas9核酸酶和特异性的向导rna构成，可实现目标基因位点敲除、敲入及定点突变等多种基因编辑。pam-knu细胞系是人端粒酶逆转录酶(htert)永生化的猪肺泡巨噬细胞系，兼具免疫细胞及可传代特性，是理想的研究先天性免疫的猪源细胞系工具。开发一种从猪细胞基因组中敲除strim56基因的方法至关重要，可为strim56抗病毒机制研究及prrs疫苗研发奠定基础。

技术实现思路

1、本发明的目的在于结合现有trim56在先天性免疫中的研究进展，利用crispr/cas9基因编辑技术，提供了一种猪trim56基因敲除质粒px459m-strim56-ko和细胞系strim56-ko-pam-knu，为猪trim56抗病毒机制研究奠定基础。

2、本发明还提供了所述猪trim56基因敲除质粒px459m-strim56-ko和细胞系strim56-ko-pam-knu的构建方法。

3、本发明还提供了所述猪trim56基因敲除系strim56-ko-pam-knu在增殖prrsv r98疫苗毒株中的应用。

4、本发明是通过以下步骤得到的：

5、一种猪trim56基因敲除质粒，在px459m质粒的hind iii酶切位点以及距离hindiii酶切位点最远的bbs i酶切位点之间插入的核苷酸序列见序列表中序列1的核苷酸序列。

6、一种猪trim56基因敲除质粒的制备方法，其特征在于通过以下步骤获得：

7、(1)设计两对猪trim56向导rna引物，其序列如下：

8、trim56-ko-5f:5'-ggcggtcgcctttgcccgtagttt-3'

9、trim56-ko-5r:5'-aaactacgggcaaaggcgaccgcc-3'

10、trim56-ko-7f:5'-gtcgtgatcctcgatcccaagttt-3'

11、trim56-ko-7r:5'-aaacttgggatcgaggatcacgac-3'

12、通过引物磷酸化及退火，形成粘性末端双链trim56-ko-5、trim56-ko-7。

13、(2)构建猪trim56基因敲除质粒px459m-strim56-ko

14、使用bbs i酶切px459m载体及ez-guide-xh载体并胶回收，将两对向导rna分别插入px459m载体、ez-guide-xh载体构建质粒px459m-sgrna5、ez-guide-xh-sgrna7，经pcr鉴定及测序分析，结果显示，重组质粒px459m-sgrna5、ez-guide-xh-sgrna7构建成功。

15、质粒px459m-sgrna5、ez-guide-xh-sgrna7分别用hind iii/xho i进行双酶切，获得载体片段px459m-strim56-ko-5和基因片段strim56-ko-7，将载体片段和基因片段连接后转化，提取质粒进行hind iii/xho i双酶切鉴定及测序分析。结果显示，敲除质粒px459m-strim56-ko构建成功。

16、所述的制备方法，优化磷酸化和退火条件如下：

17、反应体系为：trim56-ko-5f/trim56-ko-7f 1μl，trim56-ko-5r/trim56-ko-7r 1μl，10×t4 pnkbuffer 1μl，t4 pnk 1μl，ddh2o 6μl。反应条件为：37℃30min，95℃5min，按照-0.1℃/s梯度降温至25℃，25℃5min，4℃5min。

18、一种猪trim56基因敲除细胞系，将px459m-strim56-ko质粒转染至pam-knu细胞，经过嘌呤霉素筛选细胞，有限稀释法稀释细胞，获得的单克隆细胞即strim56-ko-pam-knu细胞系。

19、所述的应用，strim56敲除细胞系促进prrsv在宿主细胞中的增殖。

20、本发明的有益效果：

21、(1)本发明构建的strim56-ko-pam-knu细胞系中strim56蛋白不表达，能够应用于strim56抗病毒作用的研究；

22、(2)通过prrsv感染实验证明，strim56-ko-pam-knu细胞株比野生型pam-knu细胞株显著促进prrsv r98株增殖，所述敲除细胞系可用于增殖prrsv的研究。

技术特征：

1.一种猪trim56基因敲除质粒，其特征在于在px459m质粒的hind iii酶切位点以及距离hind iii酶切位点最远的bbs i酶切位点之间插入的核苷酸序列见序列表中序列1的核苷酸序列。

2.一种权利要求1所述的猪trim56基因敲除质粒的制备方法，其特征在于是通过以下步骤制备得到的：

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于磷酸化和退火条件如下：

4.一种猪trim56基因敲除细胞系，其特征在于猪trim56基因敲除细胞系中猪trim56基因编码区第929～2120位的1192个碱基缺失。

5.根据权利要求4所述的猪trim56基因敲除细胞系的构建方法，其特征在于通过以下步骤获得：

6.一种权利要求4所述的猪trim56基因敲除细胞系的应用，其特征在于所述细胞系促进prrsv r98株增殖。

7.一种权利要求4所述的猪trim56基因敲除细胞系的应用，其特征在于所述细胞系促进prrsv r98株病毒滴度升高。

8.一种权利要求4所述的猪trim56基因敲除细胞系的应用，其特征在于所述细胞系促进prrsv 的n蛋白表达。

技术总结
本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及猪TRIM56基因敲除质粒的构建，猪TRIM56敲除PAM‑KNU细胞系的构建，敲除细胞系中能明显促进PRRSV增殖，可以用于抗病毒作用研究。

技术研发人员：杜以军,吴香菊,齐静,张秀婷,丛晓燕,李均同
受保护的技术使用者：山东省农业科学院畜牧兽医研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15