一种高效降解木质纤维素的菌株及其应用

本发明涉及微生物，具体地说是涉及一种高效降解木质纤维素的菌株及其应用。

背景技术：

1、植物生物质中含有丰富的有机质，主要由纤维素(30％-50％)、半纤维素(20％-40％)和木质素(10％-30％)组成，是植物通过光合作用产生的次生代谢产物。木质纤维素的物理化学结构复杂多样，其中纤维素分子排列规则紧密，是植物细胞壁的主要结构；半纤维素是戊糖和己糖等单糖构成的多聚体；木质素是含氧代苯丙醇及其衍生物构成的芳香高聚物。这些成分通过氢键以及共价键相互纠缠连接，形成了复杂致密的天然网络结构，是抵抗酶攻击的天然屏障。

2、甘蔗渣生物质的主要成分是木质纤维素，是一种可再生的、丰富的资源，适合生产生物燃料和化学品等生物基产品，不仅可以作为传统石油基燃料的理想替代品，也是未来生物炼制概念的支柱。甘蔗渣资源除了极少部分用于生物炼制和制浆造纸外，主要还是被用作甘蔗制糖厂和生物乙醇厂的燃料以产生热量和电力，使用附加值低且易造成二次污染，有必要开发新的途径实现对甘蔗渣的废物利用。生物法酶解木质纤维素是一种高效环保的技术，该方法具有条件温和、能耗低、化学添加剂少等诸多优势。因此发掘与功能调控分解和转化木质纤维素的微生物资源，针对性地驱使微生物发挥专一功能利用木质纤维素，是资源化利用植物生物质的关键。

3、在之前的研究中，jian pang等(2017)在牛瘤胃中分离出了一株可以降解纤维素的大肠杆菌zh-4，zh-4的内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的活性分别为5.31u/ml、9.13u/ml和7.27u/ml。jinfei mei等(2020)得到一株解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens sl-7)，该菌株具有很强的木质素降解性能，漆酶、锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶酶活性最高分别为55.95u/l、258.57u/l和422.68u/l。lei wu等(2023)在土壤中筛选到cellulomonas iranensis zjw-6，zjw-6的木聚糖酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶和内切葡聚糖酶活性分别为13.87u/ml、2.18u/ml、5.57u/ml、10u/ml和48.27u/ml。

4、当前研究所报道的菌株存在酶活性低、酶系不完全等问题，还需进一步筛选木质纤维素降解能力较强的菌株，为提高对木质纤维素类物质的利用提供理论基础与技术支持。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种高效降解木质纤维素的菌株及其应用，该菌株具有较强的产纤维素酶和木质降解酶的能力，能够有效降解甘蔗渣中的木质纤维素。

2、为实现上述目的，本发明采用了以下的技术方案：

3、本发明所述一种高效降解木质纤维素的菌株，所述菌株命名为trichodermasp.lh-413，分类命名为木霉属trichoderma sp.；该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctcc m 2023749，保藏日期为2023年5月15日。

4、所述具有木质纤维素降解功能木霉菌的筛选方法，包括以下步骤：

5、(1)富集：取腐木样品置于样品瓶中振荡培养，取5ml悬液接种在100ml羧甲基纤维素钠液体培养基和碱性木质素液体培养基中，28℃，130rpm培养5天，使其富集；

6、(2)涂布培养：将富集培养的样品悬液进行梯度稀释，于羧甲基纤维素钠和碱性木质素固体培养基中进行涂布培养；

7、(3)分离纯化：根据培养后的菌株形态初步区分细菌和真菌，将真菌和细菌分别于pda和lb固体培养基上进行分离纯化，挑选培养3天后的单个菌落，分别在pda和lb固体培养基上进行划线纯化5-8次，直到获得纯培养；

8、(4)筛选：将纯化后的单菌株分别接种在羧甲基纤维素钠和碱性木质素固体培养基上，培养3天后，用1mg/ml刚果红溶液对羧甲基纤维素钠固体培养基的菌株染色约30min，之后倒掉染液，再用1mol/l的naci溶液脱色30min，分离出有透明圈出现的菌株，表明该菌株可能产生纤维素酶；取30ml95％(v/v)的乙醇溶液，加入0.5g愈创木酚，滴加至碱性木质素固体培养基上纯化后的菌落边缘，若滴定区显红褐色或浅红色，表示该菌株可产生漆酶；取0.1％联苯胺(v/v)和0.4％h2o2(v/v)等体积混合，滴加至碱性木质素固体培养基上纯化后的菌落边缘，若滴定区显黄褐色，表示该菌株可产生过氧化物酶；通过筛选得到一株在各染色平板上均出现明显颜色变化的菌株，即为trichoderma sp.lh-413。

9、步骤(1)所述振荡培养条件是：28℃，180rpm震荡培养1h。

10、步骤(2)所述涂布培养按以下方法进行：将富集培养的样品悬液，梯度稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的溶液，吸取200μl 10-4、10-5、10-6的稀释液于羧甲基纤维素钠和碱性木质素固体培养基中进行涂布培养5天。

11、所述的木质纤维素降解菌在发酵产纤维素酶和/或木质素酶中的应用。

12、所述纤维素酶和/或木质素酶包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、滤纸酶、漆酶、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶。

13、所述的木质纤维素降解菌在降解木质纤维素中的应用。

14、所述木质纤维素为甘蔗渣中的木质纤维素。

15、本发明获得的有益效果是：本发明所获得的木霉菌，通过酶活性测定，结果发现其内切葡聚糖酶活性为65.36u/ml、外切葡聚糖酶活性为1.75u/ml、β-葡萄糖苷酶活性为14.12u/ml、滤纸酶活性为28.04u/ml、漆酶活性为388.89u/l、木质素过氧化物酶活性为14247.31u/l、锰过氧化物酶的活性为9567.90u/l。通过与现有的研究相比，木霉菌明显优于现有技术中的菌株，其产木质纤维素降解酶的能力更强，可以在木质纤维素酶活力优化的进一步研究中发挥积极作用。其中纤维素酶中内切葡聚糖酶酶活力最高，木质素酶中木质素过氧化物酶活力最高。此外木霉菌的酶系较为完全，生长势好，具备与其他菌株配制成复合菌剂的良好基础条件，在发酵工业具有重大的应用前景。

技术特征：

1.一种高效降解木质纤维素的菌株，其特征在于：所述菌株命名为trichodermasp.lh-413，分类命名为木霉属trichodermasp.；该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctccm2023749。

2.权利要求1所述具有木质纤维素降解功能木霉菌的筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述具有木质纤维素降解功能木霉菌的筛选方法，其特征在于：步骤(1)所述振荡培养条件是：28℃，180rpm震荡培养1h。

4.根据权利要求2所述具有木质纤维素降解功能木霉菌的筛选方法，其特征在于：步骤(2)所述涂布培养按以下方法进行：将富集培养的样品悬液，梯度稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的溶液，吸取200μl10-4、10-5、10-6的稀释液于羧甲基纤维素钠和碱性木质素固体培养基中进行涂布培养5天。

5.权利要求1所述的木质纤维素降解菌在发酵产纤维素酶和/或木质素酶中的应用。

6.根据权利要求3所述木质纤维素降解菌在发酵产纤维素酶和/或木质素酶中的应用，其特征在于：所述纤维素酶和/或木质素酶包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、滤纸酶、漆酶、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶。

7.权利要求1所述的木质纤维素降解菌在降解木质纤维素中的应用。

8.根据权利要求7所述木质纤维素降解菌在降解木质纤维素中的应用，其特征在于：所述木质纤维素为甘蔗渣中的木质纤维素。

技术总结
本发明公开了一种高效降解木质纤维素的菌株及其应用，该菌种命名为Trichodermasp.LH‑413，从腐烂的木材中筛选出。该菌株在滤纸崩解试验中，添加了5％种子液的滤纸失重率达到56％，表明该菌株具有高效降解木质纤维素的能力，可以降解甘蔗渣等天然木质纤维素，将该菌株应用到甘蔗渣中木质纤维素的降解率为40％。该菌株既有助于利用木质纤维素中的生物质能，以满足人类对于能源的需求；又能将农业废弃物转化成增值产品，提高农业副产物的综合利用水平。

技术研发人员：李坚斌,郝宇浩,张玉,陆梦玲,林滨凤,李凯,黄智,邓立高,周昊
受保护的技术使用者：广西大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15