一种增强活性的胆盐水解酶以及制备与方法和应用与流程

本发明涉及酶工程，具体涉及一种增强活性的胆盐水解酶以及制备与方法和应用。

背景技术：

1、胆盐水解酶(bile salt hydrolase bsh)普遍存在于哺乳动物的胃肠道菌群中，能够水解结合型胆盐，使其生成氨基酸和游离态胆汁酸，从而降低血清中的胆固醇含量。在生物循环中，胆汁酸作为一种信号物质参与了机体脂质、胆固醇和糖的生化代谢及调节，改变胆汁酸的组成和流量可以作为一种治疗代谢综合症的新方向。

2、胆盐水解酶的制备方法通常为：通过基因工程的手段，制备含有胆盐水解酶基因的工程菌，使用工程菌表达获得胆盐水解酶。在现有技术中，工程菌的胆盐水解酶的表达量较低，获得的胆盐水解酶可溶性差，其活性和稳定性还不能同时满足工业生产的需求。因此，很有必要采用基因工程手段对酶进行改造，提升酶的活性，使其适应于工业化生产。亟需开发一种新的适用于工业大规模生产的胆盐水解酶，并将其应用于相关健康调节的药品或者保健品的生产中，这对健康医疗事业的发展将具有十分显著的意义。

技术实现思路

1、本发明意在提供一种增强活性的胆盐水解酶，以解决现有的胆盐水解酶的活性不满足应用需求的技术问题。

2、为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种增强活性的胆盐水解酶，其氨基酸序列如seq id no:1所示。

4、本方案的原理及优点是：胆盐水解酶可溶性差，活性和稳定性低，不利于大规模生产，需要对其进行改造以适应工业应用的需求。本方案将该酶的第80位的甘氨酸进行突变，变成非极性更强的氨基酸，改变了分子表面的疏水性，使胆盐水解酶的酶活得到了提升。本方案具体在bsh酶(seq id no:5)的80位甘氨酸上进行了单氨基酸的突变，突变为异亮氨酸。氨基酸突变后获得的酶，其活性得到了很大的提升。在胆盐水解酶中，影响酶学性质的位点为野生型bsh的第2位氨基酸(半胱氨酸)。本方案通过突变非酶活中心的甘氨酸(变成异亮氨酸)，改变了分子表面的疏水性，使胆盐水解酶的酶活得到了提升。

5、虽然现有技术中有通过基因突变实现酶活性改变的操作，但是针对于本方案的氨基酸序列如seq id no:5所示的胆盐水解酶(来源于长双歧杆菌bifidobacterium longum)尚无有关于基因突变操作的报道。因为没有相关现有技术的参考，给酶的基因工程改造以及关键突变位点的选择带来了极大的困难。发明人通过大量研究筛选，针对于本方案的胆盐水解酶只有在第80位的甘氨酸上进行突变才能获得同时增加活性的效果。

6、综上所述，本方案采用基因工程手段对酶进行改造，获得了一种适用于工业大规模生产的胆盐水解酶，可将其应用于相关健康调节的药品或者保健品的生产中，这对健康医疗事业的发展具有十分显著的意义。

7、进一步，一种增强活性的胆盐水解酶的核苷酸序列如seq id no:2所示。序列如seq id no:2的基因经过密码子改造，适合在大肠杆菌系统中复制以及表达。

8、进一步，一种增强活性的胆盐水解酶的制备方法，包括以下依次进行的步骤：

9、s1：获得核苷酸序列如seq id no:2所示的待表达基因；

10、s2：将所述待表达基因整合在空质粒上，获得表达载体；

11、s3：将表达载体转基因进入大肠杆菌感受态细胞，获得工程菌；

12、s4：诱导所述工程菌表达氨基酸序列如seq id no:1所示的蛋白，获得酶菌体；

13、s5：对酶菌体进行破碎处理，经离心获得上清液；过柱纯化所述上清液，获得胆盐水解酶。

14、采用上述技术方案，通过基因突变的手段获得核苷酸序列如seq id no:2所示的基因；再将基因整合在表达载体上，制备含有表达载体的工程菌；诱导工程菌表达目的蛋白，经纯化分离后即可获得高纯度的目的蛋白。

15、进一步，在s1中，通过重叠pcr获得核苷酸序列如seq id no:2所示的待表达基因。

16、采用上述技术方案，通过重叠pcr可制备获得含有标的突变的基因，重叠pcr技术成熟且易于操作。本方案对野生型胆盐水解酶的基因密码子进行优化和定点突变，适宜于在大肠杆菌中表达。

17、进一步，所述重叠pcr的引物组合包括：序列如seq id no:11所示的引物、序列如seq id no:12所示的引物、序列如seq id no:13所示的引物和序列如seq id no:14所示的引物。使用上述引物组合可以合成具有标的突变的核苷酸片段。

18、进一步，在s2中，所述空质粒含有gst标签。gst亲和标签有助于提升大肠杆菌中表达的酶蛋白的可溶性。现有技术中，在大肠杆菌中表达选取的是pet系列的载体，his亲和标签，表达量低，可溶性差多为包涵体。更换标签之后，在蛋白前段加上了gst亲和标签，提高了酶蛋白的可溶性，也有助于蛋白的正确折叠，从而提高酶的产量和活性。

19、进一步，在s3中，所述大肠杆菌感受态细胞为bl21 de3感受态细胞。bl21(de3)感受态细胞为现有技术中用于表达目的蛋白的常规菌种，易于获取和实现产业化。

20、进一步，在s4中，使用iptg诱导所述工程菌表达蛋白。iptg诱导为现有技术中工程菌表达目的蛋白的常规诱导方式，技术成熟可靠，易于操作。

21、进一步，在s5中，使用超声或者高压将酶菌体破碎；使用gst亲和柱纯化所述上清液由于空质粒上含有gst标签，可以利用gst标签来对表达出的酶进行亲和纯化。

22、进一步，一种增强活性的胆盐水解酶在制备药品、保健品或者化妆品上的应用。

23、采用上述技术方案，本方案提供的胆盐水解酶在大肠杆菌工程菌中的表达量高，表达出的酶可溶性好，并且通过基因突变的方式可提升胆盐水解酶的活性，以利于工业化放大生产。本方案获得的胆盐水解酶可以应用在药品、保健品、食品或者化妆品的制备上，具有广阔的应用前景。

技术特征：

1.一种增强活性的胆盐水解酶，其特征在于：其氨基酸序列如seq id no:1所示。

2.根据权利要求1所述的一种增强活性的胆盐水解酶，其特征在于：其核苷酸序列如seq id no:2所示。

3.一种增强活性的胆盐水解酶的制备方法，其特征在于：包括以下依次进行的步骤：

4.根据权利要求3所述的一种增强活性的胆盐水解酶的制备方法，其特征在于：在s1中，通过重叠pcr获得核苷酸序列如seq id no:2所示的待表达基因。

5.根据权利要求4所述的一种增强活性的胆盐水解酶的制备方法，其特征在于：所述重叠pcr的引物组合包括：序列如seq id no:11所示的引物、序列如seq id no:12所示的引物、序列如seq id no:13所示的引物和序列如seq id no:14所示的引物。

6.根据权利要求5所述的一种增强活性的胆盐水解酶的制备方法，其特征在于：在s2中，所述空质粒含有gst标签。

7.根据权利要求6所述的一种增强活性的胆盐水解酶的制备方法，其特征在于：在s3中，所述大肠杆菌感受态细胞为bl21 de3感受态细胞。

8.根据权利要求7所述的一种增强活性的胆盐水解酶的制备方法，其特征在于：在s4中，使用iptg诱导所述工程菌表达蛋白。

9.根据权利要求8所述的一种增强活性的胆盐水解酶的制备方法，其特征在于：在s5中，使用超声或者高压将酶菌体破碎；使用gst亲和柱纯化所述上清液。

10.根据权利要求1所述的一种增强活性的胆盐水解酶在制备药品、保健品或者化妆品上的应用。

技术总结
本发明涉及酶工程技术领域，具体涉及一种增强活性的胆盐水解酶以及制备与方法和应用。增强活性的胆盐水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，增强活性的胆盐水解酶是野生型酶的第80位的甘氨酸突变成异亮氨酸。本方案通过基因突变的手段，改变了分子表面的疏水性，解决了现有的胆盐水解酶的活性不高的技术问题。本方案的胆盐水解酶适用于工业大规模生产的胆盐水解酶，如将其应用于相关健康调节的药品或者保健品的生产中，对健康医疗事业的发展具有十分显著的意义。

技术研发人员：胡德祥,唐宗兴,何兆海,吴齐龙
受保护的技术使用者：重庆极泽生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14