一种指数扩增反应-三支催化发夹组装级联的核酸电路及制备方法

本发明属于生物传感，具体涉及一种指数扩增反应-三支催化发夹组装级联的核酸电路及制备方法。

背景技术：

1、微小核糖核酸(microrna，mirna)是一类短小的非编码内源性rna，通常为18至25个核苷酸，广泛存在于大多数真核生物中。mirna可以精准调控基因的表达，其异常表达与许多人类疾病(特别是癌症)的发生和发展密切相关，并且mirna不仅可以作为潜在的疾病标志物，也可以成为治疗靶点。

2、由于mirna具有尺寸小、丰度低以及序列相似性高等特点，对其进行检测具有极大挑战性。为了追求更低的检测限，实现更高灵敏度的检测，使生物传感器获得更好的分析性能，各种信号放大策略受到了极大的关注，特别是等温信号放大策略，已被广泛研究并设计成核酸电路集成到各种mirna生物传感策略中。

3、核酸电路的高度可编程性使其可通过自下而上的组装形成具有不同维度、不同几何形状的dna纳米结构，也易与其他核酸电路级联，以达到对目标物更高灵敏度检测的目的。级联的核酸电路经目标物引发后，通过第一个扩增反应产生大量中间体，进一步引发第二个扩增反应，从而通过形成具有不同dna纳米结构的级联产物，如线性结构、分支状或超分支化结构等，实现信号放大。因此，核酸电路可以作为一种有效的信号放大策略应用于生物传感、生物成像、生物合成学及材料学等领域。

技术实现思路

1、本发明将等温信号放大策略、dna纳米结构及核酸电路相结合，目的在于提供一种指数扩增反应-三支催化发夹组装级联的核酸电路及制备方法，以实现对mirna-21更高灵敏度的检测。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种指数扩增反应-三支催化发夹组装级联的核酸电路，所述核酸电路包括指数扩增电路(expar电路)和三支催化发夹组装电路(tbcha电路)；所述expar电路包括扩增均相反应溶液a液和扩增均相反应溶液b液；所述tbcha电路包括发夹h1、发夹h2和发夹h3；

4、所述扩增均相反应溶液a液包括目标mirna、发夹dna、dntps、1×nebuffer缓冲液和超纯水；

5、所述扩增均相反应溶液b液包括nb.bbvci切刻核酸内切酶、klenow片段、1×nebuffer缓冲液和超纯水；

6、所述目标mirna序列为5'-uagcuuaucagacugauguuga-3'；

7、所述发夹dna序列为：

8、5'-

9、tcaacatcagtctgataagctatcctcagcgcgtaggtactaatagcttatcagactgaatcctacgc-3'；

10、所述发夹h1序列为：

11、5'-bhq1-tcaacatcagtctgataagctagtaacccggttagcttatcagactga-fam-3'；

12、所述发夹h2序列为：

13、5'-fam-ctgataagctaaccgggttacactgatgttgagtaacccggttagctt-bhq1-3'；

14、所述发夹h3序列为：

15、5'-accgggttactcaacatcagttagcttatcagactgatgttgagtaac-3'；

16、所述1×nebuffer缓冲液配方为：50mm nacl、10mm tris-hcl、10mm mgcl2、1mm二硫苏糖醇，ph 7.9；

17、所述expar电路可以自循环，其以发夹dna为扩增模板，其扩增产物作为tbcha电路的燃料链；

18、所述tbcha电路可以自循环，其以y形dna纳米结构的组装输出荧光信号。

19、上述一种指数扩增反应-三支催化发夹组装级联的核酸电路的制备方法包括以下步骤：

20、1)将1μl目标mirna、1.25μl 10mm dntps、1～2μl 5μm发夹dna混匀，用1×nebuffer缓冲液补液至25μl，得到扩增均相反应溶液a液；将1～3μl 5u/μl klenow片段、1.5～3.5μl 10u/μlnb.bbvci切刻酶混匀，用1×nebuffer缓冲液补液至25μl，得到扩增均相反应溶液b液；

21、(2)将25μl扩增均相反应溶液a液与25μl扩增均相反应溶液b液混匀，得到expar反应混合物，而后将expar反应混合物置于37℃金属浴中反应30～70min；

22、(3)待步骤(2)反应结束后，将反应混合物转移至80℃金属浴中反应20min，再加入发夹h1、发夹h2和发夹h3，用1×nebuffer缓冲液补液至100μl，得到样品溶液，而后将样品溶液置于37℃金属浴中反应30～70min；

23、(4)待步骤(3)反应结束后，将样品溶液进行荧光检测；

24、其中，所述扩增均相反应溶液a液和扩增均相反应溶液b液需在冰上制备；

25、所述样品溶液中发夹h1、发夹h2和发夹h3的摩尔比为1：1：1。

26、上述一种指数扩增反应-三支催化发夹组装级联的核酸电路在制备检测mirna-21的产品中的应用。

27、本发明的显著优点在于：

28、(1)本发明的前端expar电路基于发夹dna模板的构型转变实现扩增，降低了非特异扩增的可能并对目标物进行指数型信号放大，极大地提高了检测的灵敏度；

29、(2)本发明经前端expar电路输出的扩增产物可进入expar电路循环，因此由极微量的目标物引发后即可得到大量扩增产物，实现信号放大；

30、(3)本发明利用tbcha电路组装y形dna纳米结构，将两种修饰有荧光基团与猝灭基团的dna发夹探针集中在局部范围内；

31、(4)本发明中随着y形dna纳米结构组装完成，置换出的启动链可进入tbcha电路循环，实现信号放大；

32、(5)本发明与传统的检测方法相比，无需昂贵的仪器设备、复杂耗时的样品预处理以及熟练的操作人员，更加方便经济。

技术特征：

1.一种指数扩增反应-三支催化发夹组装级联的核酸电路，其特征在于：所述核酸电路包括指数扩增电路和三支催化发夹组装电路；所述指数扩增电路包括扩增均相反应溶液a液和扩增均相反应溶液b液；所述三支催化发夹组装电路包括发夹h1、发夹h2和发夹h3；

2.根据权利要求1所述的一种指数扩增反应-三支催化发夹组装级联的核酸电路，其特征在于：所述1×nebuffer缓冲液配方为：50mm nacl、10mm tris-hcl、10mm mgcl2、1mm二硫苏糖醇，ph 7.9。

3.根据权利要求1所述的一种指数扩增反应-三支催化发夹组装级联的核酸电路，其特征在于：所述指数扩增电路可以自循环，其以发夹dna为扩增模板，其扩增产物作为三支催化发夹组装电路的燃料链。

4.根据权利要求1所述的一种指数扩增反应-三支催化发夹组装级联的核酸电路，其特征在于：所述三支催化发夹组装电路可以自循环，其以y形dna纳米结构的组装输出荧光信号。

5.如权利要求1所述的一种指数扩增反应-三支催化发夹组装级联的核酸电路的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述扩增均相反应溶液a液和扩增均相反应溶液b液需在冰上制备。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述样品溶液中发夹h1、发夹h2和发夹h3的摩尔比为1：1：1。

8.如权利要求1所述的一种指数扩增反应-三支催化发夹组装级联的核酸电路在制备检测mirna-21的产品中的应用。

技术总结
本发明提供了一种指数扩增反应‑三支催化发夹组装级联的核酸电路及制备方法。所述核酸电路包括指数扩增电路（EXPAR电路）及三支催化发夹组装电路（TBCHA电路），所述EXPAR电路包括扩增均相反应溶液A液、扩增均相反应溶液B液，所述TBCHA电路包括发夹H1、发夹H2及发夹H3。所述扩增均相反应溶液A液包括目标miRNA、发夹DNA、dNTPs、1×NEBuffer缓冲液及超纯水，所述扩增均相反应溶液B液包括Nb.BbvCI切刻核酸内切酶、Klenow片段（3'→5'exo‑）、1×NEBuffer缓冲液及超纯水。本发明通过自循环的EXPAR电路扩增出大量目标物类似物，级联后用作自循环TBCHA电路的燃料链，实现信号放大，其操作简单、具有可设计性。

技术研发人员：陈宪,赵益萍,刘佳鑫
受保护的技术使用者：福州大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14