HCVE1高表达重组蛋白、其表位肽、特异抗体、杂交瘤细胞及其应用的制作方法

本发明申请涉及分子免疫学领域，具体涉及hcv e1高表达重组蛋白、其表位肽、特异抗体、杂交瘤细胞及其应用。

背景技术：

1、丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（hcv）引起的肝脏疾病，是一个主要的全球健康威胁。据估计，全世界有5800万人长期感染丙型肝炎病毒，每年大约有150万新感染者。大约70%的感染者不能清除病毒，并发展成慢性肝炎，常常导致肝硬化，并在一定程度上导致肝细胞癌。由于尚未开发出保护性疫苗，因此迫切需要针对hcv感染的更有效、更耐受的治疗和疫苗。

2、hcv具有高度的遗传异质性，目前分为11种基因型，每种基因型包含80种亚型。因此，目前没有疫苗；然而，一些疗法对某些基因型有效，但不是所有的基因型。开发一种安全有效的hcv疫苗仍然是全球控制hcv感染的一个重要目标。因此，对hcv感染的抗体介导的中和作用的深入了解可能成为疫苗设计的关键步骤。实现有效免疫的主要挑战之一是hcv病毒的遗传多样性。可能需要产生许多中和抗体来克服这种变异性。据报道，hcv的e1糖蛋白可与细胞受体直接相互作用，并早已被认为是保护性免疫的重要免疫原性目标。

3、hcv诱导的细胞和体液免疫反应已被广泛研究。新的数据表明，单克隆抗体和多克隆抗体可以防止hcv感染。针对e1包膜糖蛋白的广义中和和被动转导的单克隆抗体可以预防hcv感染。人血清e1特异性抗体、e1-e2免疫小鼠的多克隆igg和针对hcv包膜糖蛋白的单克隆抗体可以在体外中和hcvcc（培养的hcv细胞）。到目前为止，丙型肝炎疫苗的开发主要集中在b细胞免疫反应上。然而，这些区域还没有被详细地描绘出来。

4、公开于该背景技术部分的信息仅用于加深对本公开的背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成本领域技术人员所公知的现有技术。

技术实现思路

1、基于现有研究的不足和现实需要，本申请旨在提供一种高效表达的hcv e1重组蛋白及其 b细胞表位，并诱导产生特异性中和抗体，以建立、完善hcv的鉴定方法，并为相关诊断、预防和治疗hcv试剂或药物的制备研究提供技术支撑。

2、根据本公开的一个方面，提供一种重组hcv e1蛋白，其氨基酸序列如seq id no：1所示，其编码的核苷酸序列如seqid no：2所示。

3、根据本公开的另一个方面，提供一种重组hcv e1蛋白的制备方法：经过密码子优化的hcv e1蛋白基因，构建至pcaggs载体，瞬时转染hek293f细胞，分泌表达e1蛋白，通过ni亲和层析和阴离子交换层析纯化蛋白。

4、根据本公开的再一个方面，提供一种hcv e1蛋白b细胞表位肽，其氨基酸序列为vtndcsnssivyeaad、lvgtaafcsamyvgdlc、hetvqdcncsiypghvsg 和/或ghvsghrmawdmmmn。

5、根据本公开的又一个方面，提供一种hcv e1蛋白线性多肽，用以激活b细胞产生特异性细胞免疫，含有所述表位肽，其氨基酸序列为203vtndcsnssivyeaad218、265lvgtaafcsamyvgdlc281、298hetvqdcncsiypghvsg315和/或311ghvsghrmawdmmmn325。

6、根据本公开的再一个方面，提供一种抗体或其抗原结合片段，其特异性结合所述hcv e1蛋白b细胞表位肽。

7、在本公开的一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段为下列单克隆抗体的至少一种：

8、5a10-1e：其编码单克隆抗体重链可变区的核酸序列如seq id no：3所示，轻链可变区的核酸序列如seq id no：7所示；

9、11g-1g：其编码单克隆抗体重链可变区的核酸序列如seq id no：4所示，轻链可变区的核酸序列如seq id no：8所示；

10、5g1-2c：其编码单克隆抗体重链可变区的核酸序列如seq id no：5所示，轻链可变区的核酸序列如seq id no：9所示；

11、4c10-7b：其编码单克隆抗体重链可变区的核酸序列如seq id no：6所示，轻链可变区的核酸序列如seq id no：10所示。

12、上述4株hcv e1蛋白的单克隆抗体，经ifa及wb实验验证，其可特异性识别hcv e1蛋白，效价高达1: 2.0×106，并具有良好的特异性。

13、本申请实施例中提供的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

14、1. 本申请hcv e1重组蛋白hcv e1高效表达，易于制备、纯度高，能够用于疫苗、抗体等的制备。

15、2. 本申请使hcv包膜糖蛋白e1在真核系统中以正确的空间折叠构象（192-661）表达，通过细胞融合技术建立4个小鼠单克隆细胞系，并通过western blot、免疫荧光检测、免疫过氧化物单层检测和确定抗体亚型等方法进行表征。

16、基于截短的蛋白片段与mabs的反应确定了e1蛋白结构域免疫显性表位区域及特异性识别表位，对hcv的诊断和多肽疫苗的研制具有重要价值。

17、3. 本申请鉴定得到的hcv e1蛋白线性b细胞表位丰富了e1蛋白的免疫学功能，为后续研究e1蛋白的结构特性以及抗原特性提供参考，可应用于抗病毒药物研发。

18、4. 筛选的单克隆细胞株所产生的单克隆抗体分别能够特异性的识别并结合hcve1蛋白上的203vtndcsnssivyeaad218、265lvgtaafcsamyvgdlc281、298hetvqdcncsiypghvsg315和311ghvsghrmawdmmmn325序列区域。

技术特征：

1.一种hcv e1重组蛋白，其氨基酸序列如seq id no.1所示。

2.权利要求所述hcv e1重组蛋白的编码基因，核苷酸序列如seq id no.2所示。

3.一种hcv e1蛋白b细胞表位肽，其氨基酸序列为vtndcsnssivyeaad、lvgtaafcsamyvgdlc、hetvqdcncsiypghvsg 和/或ghvsghrmawdmmmn。

4.一种hcv e1蛋白线性多肽，用以激活b细胞产生特异性细胞免疫，含有权利要求3所述表位肽，其氨基酸序列为203vtndcsnssivyeaad218、265lvgtaafcsamyvgdlc281、298hetvqdcncsiypghvsg315和/或311ghvsghrmawdmmmn325。

5.权利要求1所述hcv e1重组蛋白、权利要求3所述hcv e1蛋白b细胞表位肽或权利要求4所述hcv e1蛋白线性多肽在制备hcv诊断试剂或hcv疫苗中的应用。

6.一种抗体或其抗原结合片段，其特异性结合权利要求3所述hcv e1蛋白b细胞表位肽。

7.根据权利要求6所述抗体或其抗原结合片段，其特征在于，其为下列单克隆抗体的至少一种：

8.一种杂交瘤细胞，其分泌的单克隆抗体能特异性结合权利要求3所述hcv e1蛋白b细胞表位肽。

9.权利要求6所述抗体或其抗原结合片段或权利要求8所述杂交瘤细胞在制备hcv诊断试剂或抗hcv药物中的应用。

10.权利要求1所述hcv e1重组蛋白的制备方法，包括如下步骤：

技术总结
本申请公开了一种HCV E1高表达重组蛋白、其表位肽、特异抗体、杂交瘤细胞及其应用，旨在解决HCV检测诊断及HCV预防和治疗试剂或药物不完善、不全面的技术问题。本申请中如SEQ ID NO：1所示的重组HCV E1蛋白表达高效、易于制备；鉴定的4株特异性单克隆抗体特异性识别HCV E1蛋白的<supgt;203</supgt;VTNDCSNSSIVYEAAD<supgt;218</supgt;，<supgt;265</supgt;LVGTAAFCSAMYVGDLC<supgt;281</supgt;，<supgt;298</supgt;HETVQDCNCSIYPGHVSG<supgt;315</supgt;，<supgt;311</supgt;GHVSGHRMAWDMMMN<supgt;325</supgt;区域；本申请建立、完善了HCV的鉴定方法，并为相关诊断、预防和治疗HCV药物或疫苗的制备研究提供了有力的技术支撑。

技术研发人员：王爱萍,张改平,刘红亮,陈玉梅,周景明,丁培阳,梁超,朱习芳,刘恩平
受保护的技术使用者：龙湖现代免疫实验室
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15