一种冷冻交联蛋白海绵的制备方法与流程

本发明属于医用材料领域，具体涉及一种冷冻交联蛋白海绵的制备方法。

背景技术：

1、止血是创伤及外科手术中所有步骤的第一步，特别是在外科手术中，对止血材料的需求也是日益增长，各种止血材料、粘结剂、封闭剂及伤口敷料在创口处理中的应用迅速增加。为满足止血材料安全、有效及特异性止血，不同天然来源的生物材料均已被开发用于止血材料，如胶原蛋白、壳聚糖、葡聚糖、纤维素、海藻酸盐、淀粉、透明质酸、角蛋白、丝素蛋白等材料。

2、蛋白海绵是一种可吸收性止血材料，已经被认为是局部外伤最有效的材料之一，其通过高效地吸收血液，促进血小板凝结，物理阻隔及促进凝血酶的产生，从而实现止血的效果。

3、目前，蛋白海绵的制备工艺中常采用与交联剂共混或先对蛋白样品冻干，随后浸泡于交联剂中进行交联，随后再通过冷冻干燥的形式获得蛋白海绵；然而，通过这些方法获得的蛋白海绵均会于冷冻干燥或浸泡洗涤工艺中发生样品收缩，从而引起海绵表面产生裂纹或皱缩，影响产品的质量及成品率。

4、通过增加交联剂提高交联度可以改善蛋白海绵因收缩导致开裂的问题，但较高含量的交联剂引入的同时也会导致海绵的刚性增强，同时也带来更多的毒性物质。jp4681214b2中报道了一种通过对蛋白溶液冷冻干燥随后通过高温减压条件下加热干燥，获得不易形变的胶原海绵，但高温塑形的同时也导致了蛋白发生变性；cn106421884b中报道了一种通过在底部预冻一层冰的容器中制备蛋白海绵以减少底部因直接冷冻干燥引起条纹状裂痕，但同时该方法仅能保持有冰层处海绵表面的形态，不能改善海绵整体的收缩情况。同时上述报道的方法中并不能减少交联剂的加入量。

5、因此，本发明中提出了一种冷冻交联蛋白海绵的制备方法，通过将蛋白溶液和交联剂分离冷冻，融化交联，在较低交联剂浓度下，即可实现充分交联，且冻干后不会产生收缩和裂纹的蛋白海绵材料。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种冷冻交联蛋白海绵的制备方法，解决了低交联剂含量下蛋白海绵在冷冻干燥过程中发生收缩及裂纹的情况。

2、本发明提供了如下的技术方案：

3、一种冷冻交联蛋白海绵的制备方法，具体步骤包括如下：

4、步骤一：将蛋白粉末加入溶剂溶解，搅拌均匀后，4℃下静置消泡；

5、步骤二：将配置的蛋白溶液转移至冰箱中冷冻；

6、步骤三：将交联剂溶解于mes缓冲液中，搅拌直至完全溶解，静置消泡；

7、步骤四：将步骤三制备得到的交联剂溶液浇铸于步骤二中冷冻后的蛋白溶液上方，转移至冰箱中继续冷冻；

8、步骤五：将冷冻后的样品从冰箱中取出，室温存放下直至样品完全融化；

9、步骤六：将融化后的溶液转移至冷冻干燥机内冷冻干燥处理即可得到蛋白海绵。

10、作为一种冷冻交联蛋白海绵的制备方法的优选技术方案，步骤一中所述蛋白粉末为动物源性胶原蛋白、重组胶原蛋白、白蛋白、角蛋白、多肽、丝素蛋白、丝胶蛋白、脱细胞基质材料中的一种或多种。

11、作为一种冷冻交联蛋白海绵的制备方法的优选技术方案，步骤一中所述蛋白溶液中蛋白浓度为2～50mg/ml。

12、作为一种冷冻交联蛋白海绵的制备方法的优选技术方案，步骤一中所述静置消泡时间为0.2～4h。

13、作为一种冷冻交联蛋白海绵的制备方法的优选技术方案，步骤二中所述冷冻温度为-20～-80℃。

14、作为一种冷冻交联蛋白海绵的制备方法的优选技术方案，步骤二中所述冷冻时间为1～48h。

15、作为一种冷冻交联蛋白海绵的制备方法的优选技术方案，步骤三中所述交联剂为戊二醛、谷氨酰胺转移酶、京尼平、过氧化酶、多酚氧化酶、1,4-丁二醇二缩水甘油醚及nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)。

16、作为一种冷冻交联蛋白海绵的制备方法的优选技术方案，步骤三中所述交联剂占蛋白粉末浓度为0.2～10wt％。

17、作为一种冷冻交联蛋白海绵的制备方法的优选技术方案，步骤三中所述静置消泡时间为0.2～2h。

18、作为一种冷冻交联蛋白海绵的制备方法的优选技术方案，步骤四中所述冷冻温度为-20～-80℃。

19、作为一种冷冻交联蛋白海绵的制备方法的优选技术方案，步骤五中所述的融化时间为4～8h。

20、本发明的有益效果是：本发明以止血海绵中常见的蛋白物质为原料，采用本发明中的方法即可获得冷冻干燥获得不变形且不产生裂纹的蛋白海绵，本发明具有以下优点：1)本发明通过简单的工艺，解决了蛋白类海绵在冷冻干燥过程中因收缩产生海绵变形及裂纹的的问题；2)利用蛋白在冷冻过程中形成的有益冰晶通道，实现在更低的交联剂含量下对蛋白进行充分交联，具有更低的细胞毒性及更好的生物相容性；3)产品不需添加额外的成分，仅需对蛋白溶液及交联剂溶液分别进行冷冻，工艺简单，可实现大批量生产。

技术特征：

1.一种冷冻交联蛋白海绵的制备方法，其特征在于，具体步骤包括如下：

2.根据权利要求1所述的一种冷冻交联蛋白海绵的制备方法，其特征在于，步骤一中所述蛋白粉末为动物源性胶原蛋白、重组胶原蛋白、白蛋白、角蛋白、多肽、丝素蛋白、丝胶蛋白、脱细胞基质材料中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的一种冷冻交联蛋白海绵的制备方法，其特征在于，步骤一中所述蛋白溶液中蛋白浓度为2～50mg/ml。

4.根据权利要求1所述的一种冷冻交联蛋白海绵的制备方法，其特征在于，步骤一中所述静置消泡时间为0.2～4h。

5.根据权利要求1所述的一种冷冻交联蛋白海绵的制备方法，其特征在于，步骤二中所述冷冻温度为-20～-80℃。

6.根据权利要求1所述的一种冷冻交联蛋白海绵的制备方法，其特征在于，步骤二中所述冷冻时间为1～48h。

7.根据权利要求1所述的一种冷冻交联蛋白海绵的制备方法，其特征在于，步骤三中所述交联剂为戊二醛、谷氨酰胺转移酶、京尼平、过氧化酶、多酚氧化酶、1,4-丁二醇二缩水甘油醚或nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)。

8.根据权利要求1所述的一种冷冻交联蛋白海绵的制备方法，其特征在于，步骤三中所述交联剂占蛋白粉末浓度为0.2～10wt％。

9.根据权利要求1所述的一种冷冻交联蛋白海绵的制备方法，其特征在于，步骤三中所述静置消泡时间为0.2～2h。

10.根据权利要求1所述的一种冷冻交联蛋白海绵的制备方法，其特征在于，步骤四中所述冷冻温度为-20～-80℃。

技术总结
本发明公开了一种冷冻交联蛋白海绵的制备方法，所述材料选用常用的天然蛋白作为主要原料，并以冻干海绵形式应用于医疗领域。所述制备方法具体如下：1)蛋白溶液的准备；2)蛋白溶液静置消泡；3)蛋白溶液冷冻；4)交联剂溶液准备；5)交联剂溶液浇铸于冷冻胶原溶液上层；6)样品冷冻；7)化冻；8)冷冻干燥。本方法制得的蛋白海绵，结构更稳定，不会出现在冷冻干燥的过程出现裂痕。另外，该制备方法通过冷冻溶解的方式，使交联剂渗透性更好，从而减少交联剂加入的含量，具有更低的细胞毒性及更好的生物相容性，为蛋白海绵的制备提供了更优的方法。

技术研发人员：刘平,戴继东
受保护的技术使用者：南京普立蒙医疗科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15