一种糖基转移酶及其在生物催化合成红景天苷中的应用

本发明涉及生物工程，特别涉及一种糖基转移酶acugt8及其在生物催化合成红景天苷中的应用。

背景技术：

1、红景天苷是一种具有生物活性的酪氨酸衍生的酚类天然产物，显示出多种药理活性，包括调节代谢紊乱、缓解炎症损伤、抗肿瘤活性和肺保护作用等，近年来已将其应用于癌症、神经系统疾病、细胞衰老、脑与心脏等器官缺氧与缺血、认知障碍、皮肤斑、糖尿病等方面的治疗，具有广阔的应用市场。

2、红景天苷结构式为化学名称是2-(4-hydroxyphenyl)ethyl-betta-d-glucopyranoside，分子式c14h20o7，分子量300.3070，cas号为10338-51-9。目前红景天苷的生产主要依赖于对红景天植株的化学提取。但是，由于野生红景天生长环境海拔较高，生长缓慢，植被资源稀少，从植物中提取红景天苷代价较高，并且要经历漫长的纯化过程，导致提取效率较低。而化学方法合成红景天苷通常需要繁琐的羟基保护和脱保护反应，区域选择性低导致产率低下，并且高昂的催化剂和存在的环境污染问题进一步限制了红景天苷的工业化生产。

3、糖基化是植物体内重要的代谢进程，可用于改善天然底物的化学稳定性和水溶性，同时降低化学反应性和毒性，在药用植物的天然产物糖基化中发挥着关键的作用，在生物合成技术中存在着较大的应用前景。糖基转移酶是催化酪醇一步合成红景天苷的关键限速酶，对于红景天苷的高效工业化生物合成至关重要，因此有必要开发更多具有高催化效率，特异性催化合成红景天苷的糖基转移酶。

技术实现思路

1、本发明目的是提供一种糖基转移酶acugt8及其在生物催化合成红景天苷中的应用，糖基转移酶acugt8能够生物催化合成红景天苷且催化效率高。

2、本发明采用如下技术方案：

3、在本发明的第一方面，提供了一种糖基转移酶acugt8，所述糖基转移酶acugt8的氨基酸序列如seq id no：1所示，高效催化酪醇产生红景天苷。

4、在本发明的第二方面，提供了所述的糖基转移酶acugt8在生物合成红景天苷的应用。

5、进一步地，所述糖基转移酶acugt8通过高效糖基化酪醇的c8位置的羟基产生红景天苷。

6、在本发明的第三方面，提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体能够表达所述的糖基转移酶acugt8。

7、进一步地，所述重组表达载体所述糖基转移酶acugt8的氨基酸序列如seq id no：1所示，核苷酸序列如seq id no：2所示，acugt8密码子优化后的核苷酸序列如seq id no：3所示。

8、在一个示例性实施方式中，在本文所述的方法中使用的糖基转移酶与seq id no：1所示的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同一性。

9、在一个示例性实施方式中,在本文所述的方法中使用的糖基转移酶与seq id no：2和/或seq id no：3所示的核苷酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同一性。

10、在本发明的第四方面，提供了一种包含所述重组表达载体的重组菌或工程化细胞系。

11、在本发明的第五方面，提供了所述重组表达载体或所述的重组菌或工程化细胞系在生物催化合成红景天苷中的应用。其特征在于，所述的重组表达载体包括大肠杄菌表达载体、酵母表达载体、枯草杄菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体中的一种或两种以上；所述宿主细胞包括大肠杄菌宿主细胞(如大肠杆菌bl21、大肠杆菌dh5α等)、酵母菌宿主细胞(如酿酒酵母、毕赤酵母等)、枯草杄菌宿主细胞(如bacillus subtilis r25等)、乳酸菌宿主细胞(如lactic acid bacteria cocc101等)、放线菌宿主细胞(如streptomyces spp.等)、丝状真菌宿主细胞(如trichodermaviride等)、昆虫细胞(如bombyxmori等)、一种哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞cho、幼仓鼠肾细胞bhk等)中的一种。

12、在本发明的第六方面，提供了一种红景天苷的生物合成方法，所述方法包括：以酪醇为底物，采用所述的糖基转移酶acugt8的酶裂解液催化合成产物红景天苷。

13、进一步地，所述方法具体包括：

14、获得所述的糖基转移酶acugt8，包括：构建重组表达载体，在大肠杆菌中诱导表达糖基转移酶acugt8，后经过超声破菌获得粗酶裂解液；利用his-tag磁珠纯化法对粗酶裂解液进行蛋白纯化；向所述粗酶裂解液或者纯化酶液中添加底物酪醇于磷酸缓冲液中进行催化反应，获得红景天苷。

15、在本发明的第七个方面，提供了一种发酵生产红景天苷的方法，所述方法具体包括：以酪醇为底物，采用所述的糖基转移酶acugt8的重组菌在m9y培养基中发酵24h生产红景天苷。

16、本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

17、本发明提供的一种糖基转移酶acugt8及其在生物催化合成红景天苷中的应用，本申请人从植物落新妇转录组数据筛选得到的糖基转移酶acugt8，发现其能高效并特异性催化底物酪醇产生红景天苷，氨基酸序列如seq id no：1所示，核苷酸序列如seq id no：2所示，密码子优化后的核苷酸序列如seq id no：3所示，该糖基转移酶acugt8催化效率高，酪醇底物为2mm时转化效率为100％，本发明提供的糖基转移酶acugt8，利用工程大肠杆菌进行蛋白表达，能高效率催化酪醇生成红景天苷，整个反应过程具有操作简便、安全系数高，生产周期短、效率高、环境友好的优点，为红景天苷的工业化高效生产提供重要的参考价值。

技术特征：

1.一种糖基转移酶acugt8，其特征在于，所述糖基转移酶acugt8的氨基酸序列如seqid no：1所示，所述糖基转移酶acugt8特异性催化酪醇产生红景天苷。

2.一种糖基转移酶，其特征在于，所述糖基转移酶包括如下中的一种：

3.权利要求1所述的糖基转移酶acugt8在生物合成红景天苷中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述糖基转移酶acugt8通过糖基化酪醇的c8位置的羟基产生红景天苷。

5.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体能够表达权利要求1所述的糖基转移酶acugt8。

6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体中编码所述糖基转移酶acugt8的核酸分子包括如下中的一种：

7.一种包含权利要求5或6所述重组表达载体的重组菌或工程化宿主细胞系，其特征在于，所述的重组表达载体包括大肠杄菌表达载体、酵母表达载体、枯草杄菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体中的一种或两种以上；所述宿主细胞包括大肠杄菌宿主细胞、酵母菌宿主细胞、枯草杄菌宿主细胞、乳酸菌宿主细胞、放线菌宿主细胞、丝状真菌宿主细胞、昆虫细胞、一种哺乳动物细胞中的一种。

8.一种权利要求5或6所述重组表达载体或权利要求7所述的重组菌或工程化细胞系在生物催化合成红景天苷中的应用。

9.一种红景天苷的生物合成方法，其特征在于，以酪醇为底物，采用权利要求1所述的糖基转移酶acugt8的酶裂解液催化合成产物红景天苷，所述方法具体包括：获得权利要求1所述的糖基转移酶acugt8；构建重组表达载体，在大肠杆菌中诱导表达糖基转移酶acugt8，后经过超声破菌获得粗酶裂解液；利用his-tag磁珠纯化法对粗酶裂解液进行蛋白纯化；向所述粗酶裂解液中或纯化的酶液中添加底物酪醇于磷酸缓冲液中进行催化反应，获得红景天苷。

10.一种发酵生产红景天苷的方法，包括如下步骤:发酵培养权利要求7所述的生产红景天苷的重组菌或工程化宿主细胞系，通过添加底物酪醇，发酵12-72h收集上清产物，从发酵液产物中获得红景天苷。

技术总结
本发明提供了一种糖基转移酶及其在生物合成红景天苷中的应用。本申请人从植物落新妇转录组测序数据中筛选得到糖基转移酶AcUGT8，能够催化底物酪醇产生红景天苷。本发明的ACUGT8展示出较高的催化速率，比国内现有技术公开的专利和文献报道的糖基转移酶催化活性更高，且序列新颖，与已报道的相似功能的糖基转移酶氮基酸序列相似性为29％‑31％。本发明有助于在工业化生物合成红景天苷中提高产率。

技术研发人员：鲁丽
受保护的技术使用者：武汉大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15