一种高效的猫干扰素的生物学活性检测方法与流程

本发明涉及蛋白制品的生物学活性检测，尤其涉及一种高效的猫干扰素的生物学活性检测方法。

背景技术：

1、当前中国宠物经济已进入高速发展期，随着整体需求和认可提升，宠物猫已逐步成为宠物中占比最高的宠物，未来整体有望受益宠物渗透产业快速扩张。

2、干扰素(interferon，ifn)是宿主细胞在接受细菌，病毒，寄生虫等病原体侵染后产生并释放的可游离到细胞外的一种具有高度生物学活性的低分子量糖蛋白。而猫干扰素ω具有广谱性抗病毒作用，其与细胞表面受体结合，诱导细胞产生多种抗病毒蛋白，从而抑制病毒在细胞内的复制，对rna和dna病毒都有效。

3、2020年，首次使用口服服用核苷酸类似物与ω干扰素进行了猫冠状病毒的成功治疗。此次是由猫冠状病毒引起的非渗出性腹膜炎，前期采用口服核苷酸类似物进行治疗，效果显著，体重明显增加，球蛋白数量减少，后期采用口服干扰素进行免疫调节，最后成功治愈。

4、猫干扰素具有广谱性抗病毒作用，当猫咪出现存在病毒感染时，可以使用猫干扰素，提高免疫力，减少病毒繁殖。但就目前的检测方法用wish-vsv体系存在种属特异性，表现得生物学活性不高，猫干扰素检测并不适用，所以建立高效的猫干扰素制备和检测体系，对于更好的发挥治疗类药物作用是存在巨大意义的。

5、现有干扰素效价检测方法中，如一种新型合成干扰素-重组人血清白蛋白-人干扰素α2b融合蛋白，其生物学活性检测是根据药典收录的干扰素活性检测方法来检测；又如犬α-干扰素效价检测中，应用的是生物制品规程采用最基本的“微量细胞病变抑制法”，数据用reed-muech法统计，需计算出距离比、log4(x)与最高稀释度的倒数，计算过程繁琐。

6、我们在大量实验中发现，采用现有的上述检测方法在测猫干扰素时，存在的细胞承载干扰素能力差、易脱落、体系不稳定、效价计算方法繁琐等问题。如在细胞长至单层后加猫干扰素24h后，人羊膜细胞(wish细胞)易出现细胞破碎、变圆、类似于被80％冷丙酮固定后失去细胞活性等状态，在过24h后加水泡性口炎病毒(vsv)导致实验结果出现巨大偏差。我们还发现在猫肾细胞(f81细胞)感染vsv后细胞会出现不能全部变圆、在底部形成黑碎渣的现象，同一样品分次检测，无论在肉眼判定还是酶标仪检测都会出现大误差。此外，在效价计算上，目前市场上并没有检测猫干扰素生物学活性用的猫干扰素标准品，若没有标准品在猫干扰素样品检测结果分析并不准确。

7、因此，需要针对猫干扰素开发出一种新的生物学活性检测体系和简便的效价计算方法。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术存在的细胞承载干扰素能力差、易脱落、体系不稳定、效价计算方法繁琐等问题，尝试用人干扰素标准品作为标准品，以猫肾细胞(crfk)-vsv为检测体系，提出一种高效的猫干扰素的生物学活性检测方法，提高了细胞承载能力和体系稳定性，同时简化计算方法。此外，本发明发现标准品符合人药典检出标准且样品生物学活性高，解决了因种属特异性导致活性不高的问题。

2、为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

3、本发明提出的高效的猫干扰素的生物学活性检测方法，采用人干扰素标准品作为标准品、crfk细胞作为测定细胞、水泡性口炎病毒作为攻击毒来检测猫干扰素生物学活性，并按照下述公式计算猫干扰素待检样品效价：

4、

5、其中，待检样品半效稀释倍数为待检样品组发生50％细胞病变时稀释倍数；待检样品预稀释倍数为待检样品组发生100％细胞病变时最低稀释倍数；标准品半效稀释倍数为标准品组发生50％细胞病变时稀释倍数；标准品预稀释倍数为标准品组发生100％细胞病变时最低稀释倍数。

6、进一步地，上述的高效的猫干扰素的生物学活性检测方法，包括以下步骤：

7、s1、将培养好的crfk单层细胞，以细胞密度2.5×105-3.5×105个/ml铺板培养；

8、s2、当细胞贴壁长成单层后，将人干扰素标准品使用细胞维持液预稀释成4×105、2×105、4×104、2×104、4×103、2×103、4×102、2×102、4×101、2×101、4×100共11个稀释梯度，将猫干扰素待检样品用细胞维持液预稀释成1×106、5×105、1×105、5×104、1×104、5×103、1×103、5×102、1×102、5×101、1×101共11个稀释梯度，吸弃上清加入稀释液，100ul/孔，培养24h；

9、s3、弃上清，100ul/孔加入vsv病毒稀释液，培养24h；

10、s4、观察细胞病变孔，记录50％病变孔及100％病变孔；

11、s5、按照公式计算猫干扰素待检样品效价。

12、进一步地，所述猫干扰素为猫ω-干扰素。

13、与现有技术相比，本发明的技术效果：

14、经过大量试验分析，本发明提出了一种高效的猫干扰素的生物学活性检测方法，用人干扰素标准品作为标准品，采用crfk细胞作为测定细胞、水泡性口炎病毒作为攻击毒以及新的计算方法，不仅规避种属特异性导致生物学活性低，而且检测结果与实际值相符，体系稳定，有效避免细胞病变易脱落情况，更易观察，无论是从病变观察、种属特异性、检测体系，还是计算方法，本方法都优于现有技术方法，更适合用于猫干扰素生物学活性检测，更加简便、高效、准确。

技术特征：

1.一种高效的猫干扰素的生物学活性检测方法，其特征在于，采用人干扰素标准品作为标准品、crfk细胞作为测定细胞、水泡性口炎病毒作为攻击毒来检测猫干扰素ω生物学活性，并按照下述公式计算猫干扰素待检样品效价：

2.根据权利要求书所述的高效的猫干扰素的生物学活性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求书所述的高效的猫干扰素的生物学活性检测方法，其特征在于，所述猫干扰素为猫ω-干扰素。

技术总结
本发明公开了一种高效的猫干扰素的生物学活性检测方法，蛋白制品的生物学活性检测技术领域。本发明方法采用人干扰素标准品作为标准品、CRFK细胞作为测定细胞、水泡性口炎病毒作为攻击毒以及新的计算方法，不仅规避种属特异性导致生物学活性低，而且检测结果与实际值相符，且体系稳定，有效避免细胞病变易脱落情况，更易观察，无论是从病变观察、种属特异性、检测体系，还是计算方法，本方法都优于现有技术方法，更适合用于猫干扰素生物学活性检测，更加简便、高效、准确。

技术研发人员：夏振强,方爽爽,付玉,崔玉梅,赵健,王倩,石晶,刘伟
受保护的技术使用者：长春西诺生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14