一种基于可视化RT-LAMP的冻干型新型冠状病毒检测试剂盒的制作方法

本发明涉及一种基于可视化rt-lamp的冻干型新型冠状病毒检测试剂盒，属于新冠病毒核酸检测。

背景技术：

1、冠状病毒是一个大型病毒家族，已知可引起感冒、中东呼吸综合征(mers)和严重急性呼吸综合征(sars)等较严重疾病。新型冠状病毒(2019-ncov)是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株，是已知的第7种可以感染人的冠状病毒。

2、新型冠状病毒是一种具有包膜的正链rna病毒，主要特点是人际传播、繁殖速度快、传播率高、变异快，与其他呼吸道病毒合并感染会导致临床诊断难度增加。人感染了冠状病毒后的常见体征有常见呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染新型冠状病毒可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。

3、根据国内外新型冠状病毒的诊断指南和检测技术的研究，其检测方法主要包括病原体分离培养检测、核酸扩增检测、测序、免疫学检测等。

4、逆转录环介导恒温扩增(rt-loop-mediated isothermal amplification，rt-lamp)是在60～65℃的恒温条件下，利用耐高温逆转录酶、链置换dna聚合酶和针对靶基因6～8个区域设计的4～6条引物即可实现对rna进行快速高效扩增的检测技术。比色法rt-lamp(colorimetric rt-lamp，crt-lamp)是指反应前在体系中加入可视化染料，通过观察rt-lamp反应前后的颜色变化差异实现快速判读反应结果的核酸扩增技术。crt-lamp可以实现样本的快速检测，为基层密切接触者、疑似病例的快速筛查和处置提供方法和手段。

5、但是，现有技术中的检测新型冠状病毒crt-lamp的试剂的检测的特异性和灵敏度还不够理想。

技术实现思路

1、本发明提供了一种基于可视化rt-lamp的冻干型新型冠状病毒检测试剂盒，可以有效解决上述问题。

2、本发明是这样实现的：

3、第一方面，本发明提供一种新型冠状病毒检测rt-lamp引物组，包括内引物fip、bip，外引物f3、b3，以及环引物lf、lb；所述内引物fip、bip的核苷酸序列如seq id no:1-2所示；所述外引物f3、b3的核苷酸序列如seq id no:3-4所示；所述环引物lf、lb的核苷酸序列如seq id no:5-6所示。

4、作为进一步改进的，所述内引物、外引物、环引物的摩尔比为8：1：2。

5、第二方面，本发明提供一种新型冠状病毒检测rt-lamp反应液，包括上述的引物组、rt-lamp buffer、酶mix；所述酶mix包括bst dna聚合酶、耐高温逆转录酶、rna酶抑制剂。

6、作为进一步改进的，所述rt-lamp buffer包括(nh4)2so4、mgso4、kcl、dtt、dntps、酚红。

7、作为进一步改进的，还包括冻干保护剂，所述冻干保护剂包括6wt％蔗糖、2wt％山梨醇、6wt％peg20000、3wt％pvp k30，其余为depc水。

8、第三方面，本发明提供一种新型冠状病毒检测rt-lamp反应液的冻干方法，将所述的新型冠状病毒检测rt-lamp反应液进行分装后进行冻干，所述冻干的冻干曲线参数为：

9、预冻阶段：-50℃，2h；

10、升华干燥：-40℃，0.5h，真空度10pa；-40℃，10h，真空度10pa；

11、解析干燥：-30℃，0.5h，真空度10pa；-20℃，0.5h，真空度10pa；-10℃，0.5h，真空度10pa；0℃，0.5h，真空度10pa；10℃，2h，真空度10pa；20℃，4h，真空度10pa。

12、第四方面，本发明提供一种基于可视化rt-lamp的冻干型新型冠状病毒检测试剂盒，包括上述的rt-lamp反应液、阳性对照、阴性对照、复溶液。

13、作为进一步改进的，所述阳性对照为新型冠状病毒n基因片段质粒。

14、第五方面，本发明提供一种上述基于可视化rt-lamp的冻干型新型冠状病毒检测试剂盒的使用方法，向rt-lamp反应液加入复溶液，以复溶冻干试剂，然后依次加入处理后的待测样本核酸、阴性对照、阳性对照，混匀，进行rt-lamp反应扩增，反应结束后，观察反应管内液体的颜色变化，根据颜色变化进行结果判定。

15、作为进一步改进的，所述rt-lamp反应的反应温度为63-65℃，反应时间为28-32min。

16、本发明的有益效果是：

17、本发明中引物组的设计是技术关键，根据新型冠状病毒n基因序列设计6条特异性扩增引物，包括内引物fip和bip、外引物f3和b3、环引物lf和lb，该引物组只能特异性识别并扩增新型冠状病毒(2019-ncov)的核酸，不能扩增其他冠状病毒核酸，更不能扩增流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒、人偏肺病毒等其他呼吸道病毒的核酸，对新型冠状病毒(2019-ncov)的检测的特异性强。

18、本发明的基于可视化rt-lamp的冻干型新型冠状病毒检测试剂盒的灵敏度高，本发明在反应体系中添加了一对环引物和rna酶抑制剂，能够显著提高扩增效率，检测lod为10copies/rxn。

19、本发明的基于可视化rt-lamp的冻干型新型冠状病毒检测试剂盒在反应体系中添加了酚红指示剂，可直接根据反应前后的颜色变化而达到可视化结果判读的效果。

20、本发明提供了一种比色法rt-lamp的冻干保护剂和冻干曲线，能够使得试剂盒在常温条件下保存6个月，不依赖于低温条件保存和冷链运输，因此本发明的冻干型试剂盒既能有效保证试剂性能，又为试剂盒的保存、运输及使用提供了便捷。

21、本发明的基于可视化rt-lamp的冻干型新型冠状病毒检测试剂盒用于检测新型冠状病毒，具有快速、高效、操作简单方便、实用性好等优势，而且不需要昂贵的专门仪器，成本低。因此该试剂盒适用于现场检测，为国境口岸上有效诊断新型冠状病毒提供了便捷。

技术特征：

1.一种新型冠状病毒检测rt-lamp引物组，其特征在于，包括内引物fip、bip，外引物f3、b3，以及环引物lf、lb；所述内引物fip、bip的核苷酸序列如seq id no:1-2所示；所述外引物f3、b3的核苷酸序列如seq id no:3-4所示；所述环引物lf、lb的核苷酸序列如seq idno:5-6所示。

2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒检测rt-lamp引物组，其特征在于，所述内引物、外引物、环引物的摩尔比为8：1：2。

3.一种新型冠状病毒检测rt-lamp反应液，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物组、rt-lamp buffer、酶mix；所述酶mix包括bst dna聚合酶、耐高温逆转录酶、rna酶抑制剂。

4.根据权利要求3所述的新型冠状病毒检测rt-lamp反应液，其特征在于，所述rt-lampbuffer包括(nh4)2so4、mgso4、kcl、dtt、dntps、酚红。

5.根据权利要求3所述的新型冠状病毒检测rt-lamp反应液，其特征在于，还包括冻干保护剂，所述冻干保护剂包括6wt％蔗糖、2wt％山梨醇、6wt％peg20000、3wt％pvp k30，其余为depc水。

6.一种权利要求5所述的新型冠状病毒检测rt-lamp反应液的冻干方法，其特征在于，将所述的新型冠状病毒检测rt-lamp反应液进行分装后进行冻干，所述冻干的冻干曲线参数为：

7.一种基于可视化rt-lamp的冻干型新型冠状病毒检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求3至5任一项所述的rt-lamp反应液、阳性对照、阴性对照、复溶液。

8.一种根据权利要求7所述的基于可视化rt-lamp的冻干型新型冠状病毒检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为新型冠状病毒n基因片段质粒。

9.一种权利要求7或8所述的基于可视化rt-lamp的冻干型新型冠状病毒检测试剂盒的使用方法，其特征在于，向rt-lamp反应液加入复溶液，以复溶冻干试剂，然后依次加入处理后的待测样本核酸、阴性对照、阳性对照，混匀，进行rt-lamp反应扩增，反应结束后，观察反应管内液体的颜色变化，根据颜色变化进行结果判定。

10.根据权利要求9所述的使用方法，其特征在于，所述rt-lamp反应的反应温度为63-65℃，反应时间为28-32min。

技术总结
本发明提供一种新型冠状病毒检测RT‑LAMP引物组及基于可视化RT‑LAMP的冻干型新型冠状病毒检测试剂盒，所述引物组包括内引物FIP、BIP，外引物F3、B3，以及环引物LF、LB；所述内引物FIP、BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:1‑2所示；所述外引物F3、B3的核苷酸序列如SEQ ID NO:3‑4所示；所述环引物LF、LB的核苷酸序列如SEQ ID NO:5‑6所示。所述试剂盒包括RT‑LAMP反应液、阳性对照、阴性对照、复溶液。该试剂盒用于检测新型新型冠状病毒的特异性和灵敏度高。

技术研发人员：曾祥文,苏云鹏,洪阅滨,卓明辉,张成,田如敏
受保护的技术使用者：厦门宝太生物科技股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13