一种结直肠癌相关成纤维细胞系及其构建方法

本发明涉及生物医学，更具体地说，它涉及一种结直肠癌相关成纤维细胞系及其构建方法。

背景技术：

1、结直肠癌(crc)是世界第三大常见恶性肿瘤。肿瘤复发及转移是导致结直肠癌患者死亡的主要原因，而肿瘤微环境和肿瘤细胞的相互作用又是介导肿瘤转移的关键因素。肿瘤相关成纤维细胞是肿瘤微环境的重要组成部分，其中，结直肠癌中的肿瘤相关成纤维细胞(cancerassociatedfibroblasts，cafs)通过分泌多种生长因子、细胞因子、趋化因子及胞外基质蛋白，在结直肠癌细胞生长、迁移、侵袭、免疫逃逸等过程中发挥重要作用。研究肿瘤相关成纤维细胞的功能及作用机制对阐明结直肠癌转移机制，研发抗肿瘤药物具有重要意义。

2、现有的研究技术中已经存在分离人结直肠癌相关成纤维细胞(cafs)的方法，但是分离出来的原代人结直肠癌相关成纤维细胞往往无法长时间传代，在传至5-7代时细胞增殖活性显著降低，且细胞形态发生较大改变，不能满足诸如动物实验等细胞数量需求大的实验研究。此外，不同组织分离的肿瘤相关成纤维细胞存在批次差异、传代次数差异等，无法满足重复性实验的要求。因此，本发明拟提出一种将原代结直肠癌相关成纤维细胞进行无限传代、并保证其均一性的方法。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种结直肠癌相关成纤维细胞系及其构建方法，通过该方法构建的人结直肠癌相关成纤维细胞系能够持续传代，且经多次传代得到的人结直肠癌相关成纤维细胞的形态及活力与原代人结直肠癌相关成纤维细胞几乎没有差别，使得其能够应用于结直肠癌的相关研究。

2、本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种结直肠癌相关成纤维细胞系，所述细胞系为cafs-crc-1，保藏编号为cctccno:c2023114。

3、一种结直肠癌相关成纤维细胞系的构建方法：包含以下三个步骤：

4、s1：结直肠癌相关成纤维细胞的分离；

5、s2：结直肠癌相关成纤维细胞的永生化；

6、s3：传代得到不同代的结直肠癌相关成纤维细胞。

7、本发明进一步设置为：所述s1中结直肠癌相关成纤维细胞的分离具体步骤如下：收集的新鲜结直肠癌组织标本，置于盛有无菌pbs的离心管中，反复冲洗，小心剔除标本中的筋膜及脂肪组织，并再次用无菌pbs冲洗；将组织块转入细胞冻存管后，快速用眼科剪剪碎；将剪碎的组织收集至离心管，用pbs清洗后将其加入含有1mg/mliv型胶原酶、25u/ml透明质酸酶、20μg/mldna酶、5％fbs的组织裂解液中，摇晃孵育；孵育结束后，用细胞筛过滤裂解后的细胞悬液，离心去上清后，用pbs清洗2次，得到的细胞沉淀用10％fbs dmem/f12的完全培养基重悬，接种至细胞培养瓶，置于co2孵箱中培养，培养后30min后换液，去除未贴壁的细胞。经过3-4次传到后，得到成分较纯的结直肠癌相关成纤维细胞。

8、本发明进一步设置为：所述s2中结直肠癌相关成纤维细胞的永生化的具体操作如下：取s1中传代得到的结直肠癌相关成纤维细胞接种至6孔板，接种密度为5x105每孔，待贴壁后向每个孔中加入htert-gfp病毒浓缩液(1x107/ml)20ul，12h后换液，72h后观察荧光并扩大培养后进行流式分选，筛选gfp阳性的细胞即为成功永生化的细胞。

9、本发明进一步设置为：所述s3中传代得到不同代的结直肠癌相关成纤维细胞的具体操作如下：s2中分离成功的结直肠癌相关成纤维细胞每隔2-3天进行换液，当细胞汇合度达80％-90％时进行传代，标记好每次传代的次数及传代时间，并对不同传代次数的结直肠癌相关成纤维细胞进行冻存。

10、综上所述，本发明具有以下有益效果：通过该方法构建的人结直肠癌相关成纤维细胞系能够持续传代，实现该细胞系的永生化，且经多次传代得到的人结直肠癌相关成纤维细胞形态与活力与原代人结直肠癌相关成纤维细胞几乎没有差别，使得其能够应用于结直肠癌的相关研究。

技术特征：

1.一种结直肠癌相关成纤维细胞系，其特征是：所述细胞系为为cafs-crc-1，保藏编号为cctccno:c2023114。

2.一种结直肠癌相关成纤维细胞系的构建方法，其特征是：包含以下三个步骤：

3.根据权利要求2所述的一种结直肠癌相关成纤维细胞系的构建方法，其特征是：

4.根据权利要求2所述的一种结直肠癌相关成纤维细胞系的构建方法，其特征是：

5.根据权利要求2所述的一种结直肠癌相关成纤维细胞系的构建方法，其特征是：

技术总结
本发明公开了一种结直肠癌相关成纤维细胞系及其构建方法，涉及生物医学技术领域，其技术方案要点是：所述细胞系为CAFs‑CRC‑1该细胞系的构建方法包括结直肠癌相关成纤维细胞的分离、传代得到不同代的结直肠癌相关成纤维细胞、结直肠癌相关成纤维细胞的永生化三个步骤。通过该方法构建的人结直肠癌相关成纤维细胞系在体外培养时能够持续传代，且经多次传代后的的人结直肠癌相关成纤维细胞的形态及活力与原代人结直肠癌相关成纤维细胞几乎没有差别，使得其能够应用于结直肠癌相关的科学研究。

技术研发人员：王瑾,杨锦林
受保护的技术使用者：四川大学华西医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15