结核分枝杆菌GroEL1重组蛋白的制备方法及其应用

本发明涉及基因工程，具体涉及一种结核分枝杆菌groel1重组蛋白的构建、表达及其纯化方法和应用。

背景技术：

1、结核病(tb)是一种由耐酸性细菌结核分枝杆菌(mtb)引起的致命传染性疾病。致病性mtb难以根除，主要是由于多种因素使细菌能够逃避压力。迄今为止的研究主要集中在经典的αβt细胞的参与，然而，另一种称为γδt细胞的t细胞亚群也可能发挥重要作用。γδt细胞是执行固有免疫功能的t细胞，正常情况下，γδt细胞约占外周血t细胞总数的5％左右，其tcr由γ和δ链组成，缺乏多样性，可直接识别某些完整的多肽抗原。不需与组织相容性抗原(mhc)相结合，不需抗原提呈细胞(apc)的提呈，可以直接识别并结合抗原分子，快速响应各种感染和抗肿瘤，因此，如何在体外扩增足够数量的γδt细胞，并使其发挥特异性的杀伤功能，是科学研究和临床应用γδt细胞的一个必要前提。

2、结核分枝杆菌groel1是一种类核相关蛋白，与其他细菌伴侣蛋白一样，在热休克、氧化应激反应和巨噬细胞感染期间均上调，并且积极参与对结核分枝杆菌感染的免疫反应。支持分枝杆菌在休眠期长期存活的原因是分枝杆菌中存在稳定的蛋白质，这种蛋白质稳定性很可能是由于存在大量参与保护免受氧化应激的酶以及伴侣和dna稳定蛋白。然而，目前关于groel1在结核分枝杆菌中的主要作用仍不确定。已有研究表明，结核分枝杆菌耐热抗原可刺激γδt细胞增殖，但具体的活性多肽成分尚未确定。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种结核分枝杆菌groel1重组蛋白的制备方法，制备得到的重组groel1蛋白具有良好的免疫反应性，能在体外激活人外周血γδt细胞增殖。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种结核分枝杆菌groel1重组蛋白的制备方法，包括如下步骤：以结核分枝杆菌h37ra株groel1基因为模板设计引物，扩增获得groel1基因，将上述groel1基因连接至pet28a表达载体获得重组载体pet28a-groel1，并通过体外重组表达和纯化获得groel1蛋白；所述引物的核苷酸序列包括seq id no.1和seq id no.2。

4、优选地，所述重组载体pet28a-groel1构建时采用的限制性内切酶为nco i和xhoi。

5、优选地，所述体外重组表达包括如下步骤：将重组载体pet28a-groel1转化至大肠杆菌表达菌株bl21中，将阳性菌株接种到含卡那霉素的lb培养基中振荡培养，至od600值为0.6-0.8时诱导培养；培养后离心，所得菌体重悬至裂解液中，超声破碎，离心收集上清和沉淀。

6、优选地，所述裂解液由20mm tris-hcl和1mm pmsf组成。

7、优选地，所述沉淀用包涵体洗涤液洗涤后，再用包涵体溶解缓冲液溶解；所述包涵体洗涤液为20mm tris，1mm edta，2mol/l尿素，1mol/lnacl和1％triton x-100nacl，包涵体溶解缓冲液为20mm tris和8mol/l尿素。

8、优选地，所述纯化方法包括如下步骤：取诱导表达的groel1蛋白上清液加载至镍亲和层析柱中，收集流穿液；依次用洗杂缓冲液和蛋白洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱的重组groel1蛋白洗脱液；将上述洗脱液加入透析袋透析过夜，分析纯化后groel1蛋白纯度。

9、优选地，所述蛋白洗脱缓冲液包括20mm tris-hcl，0.5mnacl和500mm咪唑。

10、本发明还提供了一种所述制备方法获得的结核分枝杆菌groel1重组蛋白在制备激活γδt细胞增殖产品中的应用。

11、本发明还提供了一种所述制备方法获得的结核分枝杆菌groel1重组蛋白在制备结核病预防和/或治疗性疫苗中的应用。

12、本发明还提供了一种所述制备方法获得的结核分枝杆菌groel1重组蛋白在制备结核病诊断产品中的应用。

13、与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：

14、本发明利用lc-ms质谱分析技术分析mtb弱毒株h37ra的耐热混合多肽成分groel1。本发明利用原核表达系统表达并纯化结核分枝杆菌h37ra株groel1蛋白，并使用纯化后的重组groel1蛋白刺激不同个体人外周血γδt细胞，发现重组groel1蛋白能显著地刺激人γδt细胞活化增殖，流式细胞术检测γδt细胞的比例高达20％左右，高于空白对照组和il-2组的3-5倍，成功地从mtb的h37ra菌株的耐热混合多肽中寻找到可有效刺激人γδt细胞增殖的活性多肽分子groel1蛋白。本发明为未来groel1蛋白用于结核病的预防、诊断和治疗奠定基础

技术特征：

1.一种结核分枝杆菌groel1重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：以结核分枝杆菌h37ra株groel1基因为模板设计引物，扩增获得groel1基因，将上述groel1基因连接至pet28a表达载体获得重组载体pet28a-groel1，并通过体外重组表达和纯化获得groel1蛋白；所述引物的核苷酸序列包括seq id no.1和seq id no.2。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述重组载体pet28a-groel1构建时采用的限制性内切酶为ncoi和xhoi。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述体外重组表达包括如下步骤：将重组载体pet28a-groel1转化至大肠杆菌表达菌株bl21中，将阳性菌株接种到含卡那霉素的lb培养基中振荡培养，至od600值为0.6-0.8时诱导培养；培养后离心，所得菌体重悬至裂解液中，超声破碎，离心收集上清和沉淀。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述裂解液由20mm tris-hcl和1mmpmsf组成。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述沉淀用包涵体洗涤液洗涤后，再用包涵体溶解缓冲液溶解；所述包涵体洗涤液为20mm tris，1mmedta，2mol/l尿素，1mol/lnacl和1％tritonx-100nacl，包涵体溶解缓冲液为20mmtris和8mol/l尿素。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述纯化方法包括如下步骤：取诱导表达的groel1蛋白上清液加载至镍亲和层析柱中，收集流穿液；依次用洗杂缓冲液和蛋白洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱的重组groel1蛋白洗脱液；将上述洗脱液加入透析袋透析过夜，分析纯化后groel1蛋白纯度。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述蛋白洗脱缓冲液包括20mmtris-hcl，0.5mnacl和500mm咪唑。

8.权利要求1～7任意一项所述制备方法获得的结核分枝杆菌groel1重组蛋白在制备激活γδt细胞增殖产品中的应用。

9.权利要求1～7任意一项所述制备方法获得的结核分枝杆菌groel1重组蛋白在制备结核病预防和/或治疗性疫苗中的应用。

10.权利要求1～7任意一项所述制备方法获得的结核分枝杆菌groel1重组蛋白在制备结核病诊断产品中的应用。

技术总结
本发明提供了一种结核分枝杆菌GroEL1重组蛋白的制备方法及其应用，涉及基因工程技术领域。本发明利用原核表达系统表达并纯化结核分枝杆菌H37Ra株GroEL1蛋白，并使用纯化后的重组GroEL1蛋白刺激不同个体人外周血γδT细胞，发现重组GroEL1蛋白能显著地刺激人γδT细胞活化增殖，流式细胞术检测γδT细胞的比例高达20％左右，高于空白对照组和IL‑2组的3‑5倍，成功地从Mtb的H37Ra菌株的耐热混合多肽中寻找到可有效刺激人γδT细胞增殖的活性多肽分子GroEL1蛋白，为未来GroEL1蛋白用于结核病的预防、诊断和治疗奠定基础。

技术研发人员：许涛,魏婧,汪洪涛,郭方正,宋亚敏,袁美丽,王楚彤,钱中清,王效静
受保护的技术使用者：蚌埠医学院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13