检测游离B细胞刺激因子的方法与流程

本申请涉及检测游离b细胞刺激因子的方法及其应用。

背景技术：

1、b细胞刺激因子（b lymphocyte stimulator, blys）主要表达于髓系细胞表面，其为同源三聚化的ii型穿膜蛋白，属于肿瘤坏死因子家族；通常胞外区部分在蛋白酶作用下发生水解，形成可溶性blys。

2、新药研发过程中，机体和药物的相互作用，需要了解药物和疗效、药物与靶标的结合率以及毒性之前的关系。建立监测游离blys浓度随靶向blys新药给药后的变化情况，为建立药效模型奠定数据基础至关重要。

3、通过调研现有的检测blys的方法，目前无任何一个方法可以检测机体在给予针对不同的靶向blys新药后，体内游离blys浓度的变化趋势。建立一个通用的检测游离blys方法可以加速新药上市进程，同时也能为新药研究过程中，找到无创性生物标志物即药效指标提供依据。

4、目前本领域的难点在于如何能检测到游离的blys。

技术实现思路

1、第一方面，本申请提供了亲和捕获介质在制备用于检测样品中游离b细胞刺激因子的方法的试剂盒中的用途，所述方法包括以下步骤：a. 使用亲和捕获介质过滤样品；b.在预包被捕获抗体的酶标板中加入经步骤a过滤的样品并孵育；c. 用洗板液冲洗，加入检测抗体并孵育；d. 用洗板液冲洗，加入底物工作液并孵育；e. 加入终止液，使用酶标仪读取吸光度；其中所述亲和捕获介质选自：protein a琼脂糖凝胶、protein g琼脂糖凝胶和protein l琼脂糖凝胶。

2、在一个实施方式中，在步骤a之前，所述方法还包括预处理亲和捕获介质的步骤：在离心速度为2500rpm且离心时间为5分钟的条件下，使用磷酸缓冲液冲洗亲和捕获介质。

3、在一个实施方式中，步骤a的过滤包括，将样品加入亲和捕获介质中并室温过夜静置孵育，再离心收集过滤的样品。

4、在一个实施方式中，步骤b还包括，在加入经步骤a过滤的样品之后，加入assaydiluent rd1-111以封板。

5、在一个实施方式中，步骤b的孵育为在室温下以500-600 rpm振荡孵育3小时。

6、在一个实施方式中，步骤c的孵育为在室温下以500-600 rpm振荡孵育1小时。

7、在一个实施方式中，步骤d的孵育为在室温下以500-600 rpm振荡孵育30分钟。

8、在一个实施方式中，所述亲和捕获介质是protein a配体偶联于4%琼脂糖凝胶的孔径为1 μm的微孔板。

9、第二方面，本申请提供了检测样品中游离b细胞刺激因子的方法，所述方法包括以下步骤：a. 使用亲和捕获介质过滤样品；b. 在预包被捕获抗体的酶标板中加入经步骤a过滤的样品并孵育；c. 用洗板液冲洗，加入检测抗体并孵育；d. 用洗板液冲洗，加入底物工作液并孵育；e. 加入终止液，使用酶标仪读取吸光度；其中所述亲和捕获介质选自：protein a琼脂糖凝胶、protein g琼脂糖凝胶和protein l琼脂糖凝胶。

10、在一个实施方式中，在步骤a之前，所述方法还包括预处理亲和捕获介质的步骤：在离心速度为2500rpm且离心时间为5分钟的条件下，使用磷酸缓冲液冲洗亲和捕获介质。

11、在一个实施方式中，步骤a的过滤包括，将样品加入亲和捕获介质中并室温过夜静置孵育，再离心收集过滤的样品。

12、在一个实施方式中，步骤b还包括，在加入经步骤a过滤的样品之后，加入assaydiluent rd1-111以封板。

13、在一个实施方式中，步骤b的孵育为在室温下以500-600 rpm振荡孵育3小时。

14、在一个实施方式中，步骤c的孵育为在室温下以500-600 rpm振荡孵育1小时。

15、在一个实施方式中，步骤d的孵育为在室温下以500-600 rpm振荡孵育30分钟。

16、在一个实施方式中，所述亲和捕获介质是protein a配体偶联于4%琼脂糖凝胶的孔径为1 μm的微孔板。

17、第三方面，本申请提供了用于检测样品中游离b细胞刺激因子的试剂盒，所述试剂盒包括第二方面所述的方法中的试剂。

技术特征：

1.亲和捕获介质在制备用于检测样品中游离b细胞刺激因子的方法的试剂盒中的用途，所述方法包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的用途，其中在步骤a之前，所述方法还包括预处理亲和捕获介质的步骤：

3.如权利要求1所述的用途，其中步骤a的过滤包括，

4.如权利要求1所述的用途，其中步骤b还包括，

5. 如权利要求1所述的用途，其中，

6. 如权利要求1所述的用途，其中所述亲和捕获介质是protein a配体偶联于4%琼脂糖凝胶的孔径为1 μm的微孔板。

7.检测样品中游离b细胞刺激因子的方法，所述方法包括以下步骤：

8.如权利要求7所述的方法，其中在步骤a之前，所述方法还包括预处理亲和捕获介质的步骤：

9.如权利要求7所述的方法，其中步骤a的过滤包括，

10.如权利要求7所述的方法，其中步骤b还包括，

11. 如权利要求7所述的方法，其中，

12. 如权利要求7所述的方法，其中所述亲和捕获介质是protein a配体偶联于4%琼脂糖凝胶的孔径为1 μm的微孔板。

13.用于检测样品中游离b细胞刺激因子的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求7至12中任一项所述的方法中的试剂。

技术总结
本申请涉及检测样品中游离B细胞刺激因子的方法，所述方法包括以下步骤：a. 使用亲和捕获介质过滤样品；b. 在预包被捕获抗体的酶标板中加入经步骤a过滤的样品并孵育；c. 用洗板液冲洗，加入检测抗体并孵育；d. 用洗板液冲洗，加入底物工作液并孵育；e. 加入终止液，使用酶标仪读取吸光度；其中所述亲和捕获介质选自：Protein A琼脂糖凝胶、Protein G琼脂糖凝胶和Protein L琼脂糖凝胶。

技术研发人员：王变珍,王敏瑞,王琪,武丽华
受保护的技术使用者：军科正源（北京）药物研究有限责任公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13