一种鲜味寡肽及其制备方法

本发明涉及功能微生物筛选与食品生物，具体是涉及一种新型鲜味寡肽及其制备方法与应用。

背景技术：

1、鲜味肽是由食物中提取或经氨基酸合成得到的有鲜味特性的小分子肽，其分子质量通常为150至3000da。作为近年来提出的一种新型鲜味物质，鲜味肽具有良好的呈鲜效果、加工特性、以及营养价值，成为近年来食品鲜味科学的研究热点和鲜味剂开发的重点方向，引起人们的广泛关注。

2、鲜味肽可用于补充和增强食物的整体味道，使其更加和谐，柔软和浓郁；也能够在不影响食品的酸、甜、苦或咸等其他味感的基础上，通过协同作用或美拉德反应，进一步补充或增强食品的总体味感，使其风味更加协调、柔和、浓郁，在带来愉悦的味觉感受的同时，还能提供肽及氨基酸类营养成分。与此同时，鲜味肽还可以通过肽与肽、肽与核苷酸、肽与阳离子这三种方式与其他鲜味物质发生协同作用，进而达到增鲜的目的。除此之外，kim发现鲜味肽除了本身的呈鲜、增鲜效果，还可以掩盖和减弱苦味，改善食品的风味，同时具有良好的加工特性及热稳定性。

3、现代营养学研究发现，膳食蛋白经消化道各种酶作用后，相比于游离氨基酸，寡肽消化更快、吸收更多。近年来，国内外学者在许多动物源、植物源等加工或未加工食品中都发现含有鲜味肽。2018年yu等人从蚕蛹蛋白水解物中提取得到具有鲜味、甜味、涩味的寡肽vpy、aapy、gfp、tay。2019年，zhang等人从花生分离蛋白水解物中提取得到dqr、nnp、egf、edg等具有轻微鲜味的寡肽。2021年，shen等人从猪骨蛋白水解物中提取得到鲜味寡肽sy，pn，gs，lp、aphr。

4、采用传统方法从肉类、谷类或真菌类中提取的鲜味肽往往呈味不足，而且生产成本高，不能满足食品加工领域的广泛需求。与传统鲜味肽提取方法相比，从发酵食品中筛选得到高产鲜味肽的益生菌，再从其发酵液中提取鲜味肽的方法，可以进一步富集鲜味，得到呈鲜含量更高、增鲜效果更好的鲜味肽；与此同时，也更加安全、绿色、健康。因此，筛选新型的鲜味寡肽及其生产菌株，提高鲜味寡肽的品质和产量，具有重要的意义。

技术实现思路

1、本发明为解决现有技术问题，提供了一种新型鲜味寡肽及其制备方法与应用。所述鲜味寡肽是从嗜盐四链球菌(tetragenococcus halophilus)发酵液中分离提取得到的，具有浓郁的鲜味，口味延伸感强，且具有鲜味增强效果，可广泛应用于食品和调味品领域。

2、本发明一方面提供了一种新型鲜味寡肽，所述鲜味寡肽的氨基酸序列为dfe(asp-phe-glu)、lage(leu-ala-gly-glu)或qlq(gln-leu-gln)中的任意一种。

3、本发明一方面提供了上述鲜味寡肽在制备调味品、发酵食品或保健品中的应用。

4、所述调味品为味精、鸡精、鸡粉、酱油、汤块、耗油、酱、腐乳中的任意一种。

5、本发明还提供了一种鲜味剂，包含上述鲜味寡肽。

6、本发明还提供了一种鲜味剂的制备方法，包括如下步骤：

7、(1)将嗜盐四链球菌进行发酵培养，得发酵液；

8、(2)将嗜盐四链球菌发酵液进行离心，得上清液；

9、(3)将上清液进行冷冻干燥，即得鲜味剂。

10、本发明还提供了一种鲜味剂的制备方法，包括如下步骤：

11、(1)将嗜盐四链球菌进行发酵培养，得发酵液；

12、(2)将嗜盐四链球菌的发酵液经40％、60％、80％(v/v)乙醇分级沉淀；

13、(3)将80％(v/v)乙醇沉淀物进行冷冻干燥，即得鲜味剂。

14、所述嗜盐四联球菌为嗜盐四联球菌snth-1(tetragenococcus halophilus snth-1)，已于2021年08月20日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmccno.23165。

15、进一步优选的，所述鲜味剂的制备方法包括以下步骤：

16、(1)嗜盐四链球菌的发酵培养：

17、①菌株活化：

18、按1％(v/v)接种量将嗜盐四链球菌菌株接种于50ml mrs培养基中，调整ph值为8.3，在37℃条件下摇瓶培养40h，待菌株生长至对数生长期末期时，取0.5ml发酵菌液重复接种于50ml mrs培养基中，得到活化的嗜盐四联球菌；

19、②种子液培养：

20、将活化后的嗜盐四联球菌菌液接种到5l发酵罐，内有3l富集培养基，在温度37℃，转速200rpm，空气流量比1:0.5，罐压0.1kg/cm2的条件下培养24h，得到种子液；

21、③发酵罐培养：

22、将种子液转入到50l的发酵罐中，内有30l大豆蛋白基质培养基，在温度37℃，转速200rpm，空气流量比1:0.55，罐压0.12kg/cm2的条件下发酵42h，得到富含鲜味肽的发酵液；

23、(2)乙醇分级：

24、①取嗜盐四联球菌的发酵液，浓缩后加入食用级无水乙醇，配成乙醇终浓度为40％的溶液，常温搅拌30min，8000g离心30min，得沉淀物1和上清液1；

25、②将上清液1与食用级无水乙醇混合配成乙醇终浓度为60％的溶液，常温搅拌30min，8000g离心15min，得沉淀物2和上清液2；

26、③将上清液2与食用级无水乙醇混合配成乙醇终浓度为80％的溶液，常温搅拌30min，8000g离心15min，得沉淀物3和上清液3；

27、(3)将80％乙醇沉淀物3进行冷冻干燥，即得鲜味剂。

28、所述的富集培养基中各组分及其含量分别为：蛋白胨10g/l、无水乙酸钠3g/l、磷酸氢二钾2g/l、七水合硫酸镁0.575g/l、一水合硫酸锰0.25g/l、葡萄糖20g/l、柠檬酸三钠2.42g/l、酵母浸粉4g/l、牛肉浸膏8g/l、吐温80 1g/l；氯化钠150g/l、那他霉素2g/l、结晶紫500μl/l。

29、所述的大豆蛋白基质培养基中各组分及其含量分别为：大豆蛋白胨20g/l、无水乙酸钠3g/l、磷酸氢二钾2g/l、七水合硫酸镁0.575g/l、一水合硫酸锰0.25g/l、葡萄糖20g/l、柠檬酸三钠2.42g/l、吐温80 1g/l、氯化钠100g/l。

30、本发明的有益效果

31、申请人从东北自然发酵的豆酱中筛选出一株高产鲜味肽的菌株嗜盐四联球菌snth-1，其发酵上清液中鲜味多肽的含量高达25.35mg/ml-26.62mg/ml；电子舌测定鲜味值高达16.22，呈鲜味效果非常好。

32、本发明提供的三条生物源鲜味寡肽dfe、lage和qlq，是从嗜盐四联球菌snth-1发酵液中分离提取到的，其呈鲜阈值分别为0.4517mmol/l、0.2893mmol/l和0.2256mmol/l。dfe的鲜味和酸味较为突出，甜味也较强，具有一定的咸味，苦味最弱，其中鲜味味感评分为6.54，超过标准品，鲜味十分显著；lage的鲜味和甜味较为突出，其中鲜味值为5.68弱于dfe，但甜味更高，同时有一定酸味，苦味和咸味稍弱；qlq的鲜味评分为3.67，苦味较为突出，酸味、甜味和咸味均较低。

33、所述鲜味寡肽dfe为嗜盐四联球菌snth-1特产鲜味肽，鲜味最显著，有一定的厚味，并且具有鲜味增强效果，增鲜阈值达0.3839mmol/l，能明显减少模拟肉汤和酱油的苦味，增加其鲜味和咸味，可广泛添加在食品和复合调味品中，显著提升其风味，增强口味的厚重感。

34、所述鲜味寡肽dfe由其cdp-甘油磷酸转移酶[ec:2.7.8.45]调控生成；lage和qlq是由crispr相关解旋酶cas3[ec:3.1.-.-3.6.4.-]调控生成。鲜味寡肽dfe基于分子模拟可以与鲜味受体t1r1/t1r3对接，主要结合位点为位于t1r3亚基上的氨基酸残基ser256。

35、此外，本发明还提供了利用嗜盐四联球菌snth-发酵生产得到的鲜味剂。所述鲜味剂中多肽含量高达31.83mg/g-32.25mg/g，鲜味值高达16.22，呈鲜味效果非常好。所述鲜味剂中总氨基酸、游离氨基酸和肽基氨基酸含量分别为208.28mg/g、104.25mg/g和104.03mg/g，其中鲜味氨基酸含量达93.81mg/g，占全部总氨基酸的40％，游离氨基酸中鲜味氨基酸的含量达41.74mg/g，占全部游离氨基酸的45％。所述鲜味剂中富含鲜味寡肽dfe、lage和qlq和其他小分子鲜味肽类物质，具有呈味能力强、吸收速度快和营养价值高等特点。

36、本发明提供的鲜味寡肽以及鲜味剂均可广泛应用于味精、鸡精、鸡粉、酱油、汤块、耗油、酱、腐乳等调味品的生产，还可添加于发酵食品或保健品中，用于改善食品或保健品的口味应用。