一种抗SMA重组兔单克隆抗体及其应用的制作方法

本发明属于免疫化学，尤其涉及一种抗sma重组兔单克隆抗体及其应用，特别是在免疫组织化学检测方面的应用。

背景技术：

1、α-sma（alpha-smooth muscle actin, 或acta2）是一种分子量为42 kda的肌动蛋白亚型。α-sma仅在胚胎发育阶段短暂表达于心肌和骨骼肌细胞中，而对于成人平滑肌细胞具有高度特异性，故sma抗体的应用有助于识别正常或癌变组织中的平滑肌细胞和肌成纤维细胞，同时对于鉴别平滑肌瘤、平滑肌肉瘤和多型性腺癌很有价值。在正常或病变的乳房、唾液腺和汗腺中可识别肌上皮细胞，也许有助于排出肿瘤侵袭的可能性。因此筛选一株高灵敏度、强特异性的抗sma抗体，对识别和检测肿瘤细胞或免疫细胞上sma蛋白的表达具有非常重要的作用。

技术实现思路

1、（一）要解决的技术问题

2、鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种抗sma重组兔单克隆抗体及其应用，所述抗sma重组兔单克隆抗体应用广泛，并能准确识别sma的表达，经过多种不同组织的免疫组织化学检测发现，该抗体可以很好的检测到肿瘤细胞或免疫细胞上sma蛋白的表达，可应用于免疫组织化学(ihc)、间接elisa、免疫印记(western blotting)、抗体芯片制备、流式细胞术等检测与筛查领域。本发明还涉及编码该抗sma重组兔单克隆抗体的核苷酸序列、重组质粒或表达载体、制备方法及抗sma重组兔单克隆抗体在sma蛋白检测方法或装置中的应用等。

3、（二）技术方案

4、为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

5、第一方面，本发明提供一种抗sma重组兔单克隆抗体，其包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no.4所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.5所示。

6、抗sma重组兔单克隆抗体（sma兔源抗体）可用于免疫组织化学检测，能高特异性和高灵敏度地识别和检测肿瘤细胞或免疫细胞上sma蛋白的表达。

7、所述抗sma单克隆抗体由哺乳动物细胞重组表达获得。具体地，本发明提供的抗sma重组兔单克隆抗体是通过兔杂交瘤融合筛选，293细胞真核表达产生。在制备所述抗sma单克隆抗体时，免疫兔子（新西兰大白兔）用的抗原为合成多肽，所述合成多肽的氨基酸序列如seq id no.1所示，其由人工化学合成得到。免疫兔子后，经细胞融合、克隆筛选，获得可高效分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞系，并使用分子克隆技术获得编码所述抗体的重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列的核苷酸序列，将核苷酸序列构建在真核表达载体上，通过转染试剂转染到293细胞系，收集细胞上清，经protein a柱亲和层析纯化细胞上清，获得兔单克隆抗体。免疫组织化学检测显示该抗体能特异性识别sma蛋白。

8、所述抗sma单克隆抗体能够识别重组sma抗原蛋白和肿瘤细胞和免疫细胞上的sma分子；所述抗sma单克隆抗体还可以应用在免疫组化病理诊断剂中。

9、第二方面，本发明提供编码基因，用于编码上述抗sma重组兔单克隆抗体。

10、优选地，所述编码基因包括如seq id no.2所示的dna序列，用于编码所述抗sma重组兔单克隆抗体的重链可变区；以及如seq id no.3所示的dna序列用于编码所述抗sma重组兔单克隆抗体的轻链可变区。

11、第三方面，本发明涉及一种核酸分子，其包括用于编码所述抗sma重组兔单克隆抗体的编码基因。

12、第四方面，本发明保护一种表达载体或重组质粒，其包括上述的核酸分子。

13、第五方面，本发明提供一种抗sma重组兔单克隆抗体的制备方法，采用上述表达载体转染细胞，培养转染后的细胞，收集细胞上清液并纯化，得到所述抗sma重组兔单克隆抗体。

14、更优选地，所述制备方法包括如下步骤：

15、（1）免疫兔子：先对sma蛋白分子序列进行分析，依据sma在细胞膜上的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择和使用合适的多肽序列作为免疫原，经由klh或ova偶联后作为免疫原，免疫兔子；所述多肽为seq id no.1所示的人工合成多肽；

16、（2）制备杂交瘤细胞系：经细胞融合、克隆筛选，获得可高效分泌抗体的阳性杂交瘤稳定细胞系，从杂交瘤细胞系中分离出总rna；

17、（3）获得抗体序列：利用特异性的引物，通过pcr扩增技术获得抗体重链可变区和抗体轻链可变区的核苷酸序列；

18、（4）抗体表达和纯化：将所述核苷酸序列克隆至表达载体中，使用转染方法瞬时转染培养的细胞，培养后收集上清，使用protein a纯化上清液，得到纯度＞95％的抗体。

19、第六方面，所述的抗sma重组兔单克隆抗体、编码基因、核酸分子、表达载体或重组质粒在制备sma蛋白分子检测装置中的应用。所述检测装置包括但不限于sma检测试剂盒、抗体芯片或抗体探针等。

20、第七方面，本发明还提供一种sma检测试剂盒，其包括上述的抗sma重组兔单克隆抗体和免疫组织化学检测试剂。

21、优选地，所述sma检测试剂盒包括：抗sma重组兔单克隆抗体、hrp酶标二抗、edta修复液、过氧化氢酶封闭液、dab浓缩液、dab缓冲液、苏木素、返蓝液。

22、在进行免疫组织化检测时，检测步骤包括脱蜡、抗原修复、内源性过氧化物酶失活、封闭、一抗孵育、二抗孵育、dab显色、复染、脱水、封片和镜检等。

23、（三）有益效果

24、本发明提供的抗sma重组兔单克隆抗体，与sma蛋白分子的结合具有高特异性和高灵敏度，能够特异性地识别和检测肿瘤细胞或免疫细胞上sma蛋白的表达，在检测sma蛋白时呈阳性高表达，因此该抗体可应用于免疫组织化学(ihc)、间接elisa、免疫印记(westernblotting)、抗体芯片制备、流式细胞术等检测与筛查领域，有利于获得准确的评估和检测结果。本发明的103b8g8克隆的sma重组兔单克隆抗体由于其特异性好，阳性信号强等特点，在ihc染色中染色效果更明显，有利于准确检测区分癌症。

技术特征：

1.一种抗sma重组兔单克隆抗体，其特征在于，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no.4所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.5所示。

2.编码基因，其特征在于，用于编码权利要求1所述的抗sma重组兔单克隆抗体。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，其包括：如seq id no.2所示的dna序列，以用于编码所述抗sma重组兔单克隆抗体的重链可变区；以及如seq id no.3所示的dna序列，以用于编码所述抗sma重组兔单克隆抗体的轻链可变区。

4.一种核酸分子，其特征在于，其含有权利要求2或3所述的编码基因。

5.一种表达载体或重组质粒，其特征在于，其含有权利要求4所述的核酸分子。

6.一种抗sma重组兔单克隆抗体的制备方法，其特征在于，其采用权利要求5所述的表达载体对细胞进行转染，转染后继续培养细胞，收集细胞上清液并纯化，得到所述抗sma重组兔单克隆抗体。

7.权利要求1所述的抗sma重组兔单克隆抗体、权利要求2或3所述编码基因、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的表达载体或重组质粒在制备sma检测试剂盒、抗体芯片或抗体探针中的应用。

8.一种sma检测试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1的抗sma重组兔单克隆抗体和免疫组织化学检测试剂。

9.根据权利要求8所述的sma检测试剂盒，其特征在于，其包括：抗sma重组兔单克隆抗体、hrp酶标二抗、edta修复液、过氧化氢酶封闭液、dab浓缩液、dab缓冲液、苏木素和返蓝液。

技术总结
本发明涉及一种抗SMA重组兔单克隆抗体及其应用，所述抗SMA重组兔单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。相比市售的抗SMA单克隆抗体，本发明提供的抗SMA重组兔单克隆抗体，与SMA蛋白具有更高亲和力，可高特异性和高灵敏度地识别和检测肿瘤细胞或免疫细胞上SMA蛋白的表达，可应用于免疫组织化学(IHC)、间接ELISA、免疫印记(Western blotting)、抗体芯片制备、流式细胞术等检测与筛查领域，有利于获得更准确的检测和评估结果，并降低检测成本和背景信号的干扰。

技术研发人员：谢斌,刘杨,付玉环
受保护的技术使用者：苏州百道医疗科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13