一种磷酸化蛋白质的纯化和分析方法

本发明涉及生物分析，尤其涉及一种磷酸化蛋白质的纯化和分析方法。

背景技术：

1、蛋白质可逆磷酸化是一种重要的翻译后修饰，细胞中有超过30％的蛋白质被不同程度磷酸化修饰。磷酸化修饰会改变蛋白质的结构、活性、亚细胞定位、相互作用、稳定性等。这些改变会影响动植物生命活动的很多过程，包括细胞分裂、增殖、发育、分化、病理和环境应答等。因而，蛋白质磷酸化在细胞信号转导过程中起着极其重要的调控作用。由于磷酸化修饰在细胞中存在的普遍性和调控功能的重要性，众多科学工作者对研究和分析磷酸化蛋白质功能的产生了强烈的兴趣和关注。

2、然而，现有的方法分析磷酸化蛋白有很多缺点，例如，纯化效率低、而商业化试剂盒价格昂贵等。因此,有必要提供一种高效、便宜、容易操作的分离纯化磷酸化蛋白质的技术方法。

技术实现思路

1、为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种磷酸化蛋白质的纯化和分析方法。

2、第一方面，本发明提供一种磷酸化蛋白质的纯化方法，包括：

3、使用金属氢氧化物富集待测蛋白质得到第一富集产物；

4、酶解消化所述第一富集产物之后，使用ivb族元素的金属氧化物富集磷酸化肽段得到第二富集产物。

5、在本发明的一个实施方式中，所述金属氢氧化物为al(oh)3；所述ivb族元素的金属氧化物为氧化钛或氧化锆。

6、在本发明的一个实施方式中，所述使用金属氢氧化物富集待测蛋白质得到第一富集产物包括：

7、混合所述待测蛋白质、溶解缓冲液和所述金属氢氧化物；

8、所述金属氢氧化物的用量为60～100mg/1mg蛋白质；所述溶解缓冲液包括：尿素、乙磺酸、谷氨酸钾、天冬氨酸钠和表面活性剂。

9、优选地，所述溶解缓冲液中，尿素为6～10m、乙磺酸为20～40mm、谷氨酸钾为0.1～0.5m、天冬氨酸钠为0.1～0.5m，表面活性剂为chaps，质量体积百分含量为0.4～2％。

10、更进一步优选地，所述溶解缓冲液中，尿素为8m、乙磺酸为30mm、谷氨酸钾为0.2m、天冬氨酸钠为0.2m，表面活性剂为chaps，质量体积百分含量为0.5％。

11、在本发明的一个实施方式中，在混合所述待测蛋白质、溶解缓冲液和所述金属氢氧化物之后，于4℃～0℃的条件下混匀20～40分钟；

12、之后采用所述溶解缓冲液清洗所述金属氢氧化物至少一次并丢弃清洗液，保留所述金属氢氧化物；

13、之后采用第一洗脱液洗脱至少一次，保留和合并洗脱液。

14、优选地，所述第一洗脱液包括尿素和焦磷酸钾；所述尿素为6～10m，所述焦磷酸钾为80～120mm。

15、更进一步优选地，所述尿素为8m，所述焦磷酸钾为100mm。

16、在本发明的一个实施方式中，所述酶解消化包括：

17、采用lysc预酶切2～4小时，用乙腈和碳酸氢铵稀释后，采用胰蛋白酶在36～38℃的条件下酶切6～18小时。

18、优选地，所述用乙腈和碳酸氢铵稀释包括：

19、用5～15％乙腈(v/v)和10～50mm碳酸氢铵溶液稀释2～6倍。

20、在本发明的一个实施方式中，所述使用ivb族元素的氧化物富集磷酸化肽段得到第二富集产物包括：

21、在平衡液中，将酶解消化后的第一富集产物和ivb族元素的金属氧化物混合处理20～40分钟，弃除溶液，保留金属氧化物；清洗之后采用第二洗脱液洗脱金属氧化物至少一次，保留和合并洗脱液。

22、在本发明的一个实施方式中，所述平衡液包括乳酸、乙腈和tfa；所述第二洗脱液包括乙腈和氨水。

23、优选地，所述平衡液中乳酸为20～40mg/ml，乙腈的体积百分含量为60～90％，tfa的体积百分含量为0.05～5％。

24、更进一步优选地，所述平衡液中乳酸为30mg/ml，乙腈的体积百分含量为80％，tfa的体积百分含量为0.1％。

25、优选地，所述第二洗脱液中乙腈为体积百分含量10-50％，氨水为10～100mm。

26、更进一步优选地，所述第二洗脱液中乙腈为体积百分含量20％，氨水为50mm。

27、本发明中平衡液一定要保持酸性(ph<5),洗脱液一定要保持碱性(ph>9)，可以具备较好的纯化效果。

28、在本发明的一个实施方式中，所述清洗步骤包括：

29、采用所述平衡液清洗金属氧化物至少一次，离心并丢弃清洗液。

30、第二方面，本发明提供一种磷酸化蛋白质的分析方法，包括：

31、采用所述的纯化方法富集待测蛋白质中的磷酸化蛋白质，之后进行检测。

32、在本发明的一个实施方式中，将所述第二富集产物经过脱盐和抽干后，采用高分辨质谱进行磷酸化鉴定。

33、第三方面，本发明提供一种用于纯化和检测磷酸化蛋白质的试剂盒，包括：

34、al(oh)3、溶解缓冲液、lysc、胰蛋白酶和金属氧化物，所述金属氧化物为tio2或zro2。

35、本发明具备如下有益效果：

36、本发明采用金属氢氧化物和ivb族元素的金属氧化物，经过两步富集方法富集磷酸化蛋白质，显著提高了磷酸化蛋白或磷酸化位点的鉴定率，提高了30％以上。本发明提供的方法适用于某一特定蛋白质，或者蛋白质混合物的大规模磷酸化修饰分析，同时具备较高的重复性和覆盖率，较大程度上提高了检测效率，为研究蛋白质功能和细胞信号转导提供了重要的技术资源。

技术特征：

1.一种磷酸化蛋白质的纯化方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述金属氢氧化物为al(oh)3；和/或，所述ivb族元素的金属氧化物为氧化钛或氧化锆。

3.根据权利要求1或2所述的纯化方法，其特征在于，所述使用金属氢氧化物富集待测蛋白质得到第一富集产物包括：

4.根据权利要求3所述的纯化方法，其特征在于，在混合所述待测蛋白质、溶解缓冲液和所述金属氢氧化物之后，于4℃～20℃的条件下混匀20～40分钟；

5.根据权利要求1-4任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述酶解消化包括：

6.根据权利要求1-5任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述使用ivb族元素的氧化物富集磷酸化肽段得到第二富集产物包括：

7.根据权利要求6所述的纯化方法，其特征在于，

8.一种磷酸化蛋白质的分析方法，其特征在于，包括：

9.根据权利要求8所述的分析方法，其特征在于，包括：

10.一种用于纯化和检测磷酸化蛋白质的试剂盒，其特征在于，包括：

技术总结
本发明涉及生物分析技术领域，尤其涉及一种磷酸化蛋白质的纯化和分析方法。所述分析包括：使用金属氢氧化物富集待测蛋白质得到第一富集产物；酶解消化所述第一富集产物之后，使用IVB族元素的金属氧化物富集磷酸化肽段得到第二富集产物；针对所述第二富集产物进行检测。本发明采用金属氢氧化物和IVB族元素的金属氧化物，经过两步富集方法富集磷酸化蛋白质，显著提高了磷酸化蛋白或磷酸化位点的鉴定率，提高了30％以上。本发明提供的纯化和分析方法可以有效提高蛋白质磷酸化修饰检测的重复性和覆盖率，同时缩短了分离和检测时间，提高了检测效率。

技术研发人员：陈艳梅
受保护的技术使用者：中国农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/12/2