用于培养结膜上皮细胞的组合物及其培养体系和用途

本发明属于细胞培养，具体涉及结膜上皮细胞的培养技术。

背景技术：

1、结膜作为眼表的保护性屏障，是覆盖巩膜表面的一层粘膜组织。结膜上皮细胞主要包括两类细胞：杯状细胞(gcs)和角质细胞(非杯状细胞，non-gcs)。结膜杯状细胞是一种高度分化的上皮细胞，其可以分泌粘蛋白muc5ac、防御素等物质。这些物质在构成并稳定泪膜、润滑眼表、清除病原体以及维持粘膜屏障完整性方面起着重要作用。除此以外，结膜杯状细胞也是眼表固有免疫系统的重要组分之一。它们可以将眼表的病原体传递给结膜基质中的抗原递呈细胞，并产生免疫调节因子如tgf-β等，这些功能均表明杯状细胞在维持眼表免疫稳态方面起到重要作用。因此，维持结膜结构和功能的完整性对眼表健康至关重要。

2、杯状细胞数量的减少和功能的降低与很多眼部疾病相关，如干眼症、史蒂文-约翰逊综合征、sjogren综合征、眼部瘢痕性类天疱疮以及移植物抗宿主病等。但是临床上针对这些疾病的治疗通常集中在抗炎，镇痛以及免疫抑制等方面，这些方法既不能修复结膜上皮也不能促进杯状细胞再生。为了解决以上的问题，移植增殖功能良好的结膜上皮细胞是一个可行的方法，然而这种方法受限于种子细胞的缺乏。

3、在其他团队先前的研究中，结膜上皮细胞主要是通过将结膜组织培养在含有血清的rpmi-1640中得到的。但是从组织培养中得到的上皮细胞可能会混有少量的其他细胞，而且培养基中的血清会限制后续细胞的增殖能力。除了上面的方法，先前的研究通常会借助3t3滋养层细胞来建立增殖能力较好的结膜上皮细胞培养体系，但这种方式面临许多问题，并且不能满足临床移植的要求。因此，近些年来探究采用无血清以及无滋养层细胞的体系来体外培养结膜上皮细胞成了一个研究热点，而在其他研究的培养体系中，最后结膜上皮细胞中几乎没有muc5ac的表达。因此，优化后的培养体系仍然无法有效提高结膜上皮细胞的扩增能力并维持细胞形态和特征。除此之外，小鼠结膜上皮细胞的原代培养和其他物种相比更有挑战性，这也限制了转基因小鼠结膜和杯状细胞方面的体外研究。因此，我们的研究主要探究建立一个简单、稳定且高效的结膜上皮细胞培养体系。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了用于培养结膜上皮细胞的组合物及其培养体系和用途。

2、本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：

3、一种用于培养结膜上皮细胞的组合物，所述组合物包括y27632、forskolin和sb431542。

4、优选地，所述组合物由y27632、forskolin和sb431542组成。

5、一实施例中：所述y27632、forskolin和sb431542的摩尔比为0.8～1.2：1.8～2.2：0.8～1.2。

6、本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：

7、一种体外培养结膜上皮细胞的培养体系，所述培养体系包括上述的组合物，还包括无血清培养基。

8、优选地，所述培养体系由y27632、forskolin、sb431542、无血清培养基，以及其他必要的培养组分(如抗生素等)组成。

9、优选地，所述y27632在所述培养体系中的浓度为8～12μm。

10、优选地，所述forskolin在所述培养体系中的浓度为18～22μm。

11、优选地，所述sb431542在所述培养体系中的浓度为8～12μm。

12、本发明解决其技术问题所采用的技术方案之三是：

13、一种上述的组合物在制备结膜上皮细胞的增殖促进剂中的用途。

14、本发明解决其技术问题所采用的技术方案之四是：

15、一种上述的组合物在制备结膜上皮细胞的分化促进剂中的用途，所述用途为促进结膜上皮细胞分化为杯状细胞。

16、本发明的组合物及培养体系可用于各类结膜上皮细胞的培养、促进增殖、促进分化为杯状细胞，尤其是针对小鼠原代结膜上皮细胞。本发明的组合物及培养体系可用于体内或体外培养，尤其是体外培养。

17、本发明发现了三种小分子化合物y27632、forskolin和sb431542组合成的组合物(记为3c)可以原代培养结膜上皮细胞，促进细胞贴壁，维持细胞干性并调控细胞分化。本发明还开发了一个以3c为核心的培养体系，以促进结膜上皮的贴壁和增殖。本发明还进一步探究了在3c条件下，结膜上皮细胞的增殖能力以及其分化为杯状细胞的能力，这将为组织工程结膜上皮奠定理论基础。同时，本发明也研究了3c在体内条件下促进结膜上皮细胞增殖的作用，这可以为临床治疗结膜疾病提供新的可行选择。

18、本发明所涉及的设备、试剂、工艺、参数等，除有特别说明外，均为常规设备、试剂、工艺、参数等，不再作实施例。

19、本发明所列举的所有范围包括该范围内的所有点值。

20、本发明中，所述“室温”即常规环境温度，可以为10～30℃。

21、本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：

22、结膜上皮可以分泌粘蛋白并含有多种免疫细胞，这在保护眼表方面有关键作用。然而，在一些眼表疾病中，结膜上皮的稳态会被打破，如干眼等。目前来说，结膜上皮的移植和重建可以治疗这些疾病，但这种治疗方式常常受限于多能结膜上皮细胞的培养。由于动物源性感染和异种移植排斥的风险，先前研究中使用牛血清或小鼠滋养层细胞培养的结膜上皮细胞的方法不适合于临床应用。因此，本发明仅使用含有y27632、forskolin和sb431542的小分子化合物组合物(3c)配合无血清培养基的方式来培养结膜上皮细胞，结果证实，3c培养小鼠结膜上皮细胞可以促进细胞的贴壁、增殖与分层，同时3c也可以促进结膜上皮祖细胞分化为杯状细胞。此外，在体实验也证实3c可以促进结膜上皮的修复与杯状细胞的分化。本发明提供的3c配合无血清培养基的培养体系不仅可以体外扩增结膜上皮细胞，还可以保持其分化为杯状细胞的潜能，同时为随后体外研究结膜上皮细胞以及临床治疗眼表疾病提供新的可能性。

技术特征：

1.一种用于培养结膜上皮细胞的组合物，其特征在于：所述组合物包括y27632、forskolin和sb431542。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述y27632、forskolin和sb431542的摩尔比为0.8～1.2：1.8～2.2：0.8～1.2。

3.一种体外培养结膜上皮细胞的培养体系，其特征在于：所述培养体系包括权利要求1或2所述的组合物，还包括无血清培养基。

4.根据权利要求3所述的培养体系，其特征在于：所述y27632在所述培养体系中的浓度为8～12μm。

5.根据权利要求3所述的培养体系，其特征在于：所述forskolin在所述培养体系中的浓度为18～22μm。

6.根据权利要求3所述的培养体系，其特征在于：所述sb431542在所述培养体系中的浓度为8～12μm。

7.一种权利要求1或2所述的组合物在制备结膜上皮细胞的增殖促进剂中的用途。

8.一种权利要求1或2所述的组合物在制备结膜上皮细胞的分化促进剂中的用途，所述用途为促进结膜上皮细胞分化为杯状细胞。

技术总结
本发明公开了用于培养结膜上皮细胞的组合物及其培养体系和用途。本发明使用小分子化合物组合物(3C)配合无血清培养基的方式来培养结膜上皮细胞，可以促进细胞的贴壁、增殖与分层，促进结膜上皮祖细胞分化为杯状细胞，在体实验也证实3C可以促进结膜上皮的修复与杯状细胞的分化。本发明提供的培养体系不仅可以体外扩增结膜上皮细胞，还可以保持其分化为杯状细胞的潜能，为随后体外研究结膜上皮细胞以及临床治疗眼表疾病提供新的可能性。

技术研发人员：李程,王淑荣,徐丽娜,王国良
受保护的技术使用者：厦门大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15