一种转谷氨酰胺酶催化的咸味增强肽的制备方法

本发明属于食品加工，具体涉及一种转谷氨酰胺酶催化的咸味增强肽的制备方法。

背景技术：

1、随着社会的快速发展，人民的美好生活愿望越来越突显，在饮食上追求更加健康、营养、美味的食品。众所周知，食盐是最主要的咸味来源。饮食中食盐的摄入对维持人体内稳态至关重要，除此之外，食盐还可以提高产品的风味和口感、改善产品的结构，起到防腐保鲜的作用，但长期过量摄入钠盐会增大心律不齐、冠心病、高血压等心血管疾病的患病风险。调查显示，全球约半数国家的人均每日食盐摄入量是世界卫生组织推荐摄入量的两倍多。因此，“减盐”而“不减咸”显得格外重要。咸味增强肽可以在不增加钠离子浓度的情况下增强产品的咸味，还能在一定程度上提高产品的营养价值。在食品工业生产中，适当使用咸味增强肽替代氯化钠，可以有效减少食盐摄入量。

2、研究表明一些食源性多肽与还原糖在高温下发生美拉德反应，生成1-5kda的糖肽产物具有显著的咸味增强作用。然而，高温下发生美拉德反应生成美拉德肽的同时，也生成了一些具有一定毒性和致癌特性的美拉德反应产物，如5-羟甲基糠醛、丙烯酰胺、杂环胺、晚期糖基化终末产物等。在37℃下，借助转谷氨酰胺酶的酶法糖基化反应，以多肽为酰基供体，氨基葡萄糖为酰基受体，有望制备具有咸味增强效果的咸味增强肽。因此，探索酶法糖基化途径制备新型咸味增强肽，控制制备温度，避免生成具有一定毒性和致癌特性的物质，提高产品的安全性具有重要意义。

3、罗非鱼是世界上第二大养殖鱼类，具有生成速度快、产量高、繁殖力强、适应性强等特点。据统计，2018年全球罗非鱼产量约650万吨，其中，中国产量最高。罗非鱼加工过程中会产生大量鱼皮、鱼鳞、鱼骨、内脏等副产物，约占鱼体的60％-70％。罗非鱼鱼皮富含胶原蛋白，是一种良好的蛋白质来源。最重要的是，与其他蛋白质水解物相比，胶原蛋白水解物是温和的。风味蛋白酶同时具备内切酶和外切酶的活性，对多肽分子末端疏水性基团有特异性，可以通过将末端疏水性基团降解为氨基酸来有效降低酶解产物的苦味，获得风味良好的蛋白水解物。以罗非鱼鱼皮胶原为原料，基于水解合成双修饰制备技术，制备具有良好增咸效果的咸味增强肽，实现罗非鱼加工副产物鱼皮的高值化，为食品工业“减盐不减咸”提供新思路。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种转谷氨酰胺酶催化的咸味增强肽的制备方法，以克服美拉德咸味增强肽存在的毒性和致癌特性的风险，提高产品的安全性，为转谷氨酰胺酶催化的酶法糖基化反应提供理论基础，为制备以鱼皮胶原为原料的咸味增强肽产品提供参考。

2、为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

3、一种转谷氨酰胺酶催化的咸味增强肽的制备方法，所述方法包含以下步骤：

4、(1)鱼皮胶原水解物的制备：取一定质量的罗非鱼鱼皮胶原，溶解于去离子水中，添加风味蛋白酶分别水解1-6h，水解过程中不调节ph(避免引入na+干扰咸味的分析)。水解反应结束后，在沸水浴中灭酶，冷却至室温后，离心，取上清液即为鱼皮胶原水解物；

5、(2)1-5kda鱼皮胶原多肽的制备：使用有机膜分离机使步骤(1)中的鱼皮胶原水产物进行超滤处理，收集1-5kda鱼皮胶原水解物组分，使用真空冷冻干燥机干燥成1-5kda多肽粉末，并在-20℃冰箱中储存；

6、(3)咸味增强肽的制备：取一定质量步骤(2)中的1-5kda的多肽粉末溶解于去离子水中，添加氨基葡萄糖，然后分别添加酶浓度为0.5-1.5％的转谷氨酰胺酶反应1-5h，反应结束后在沸水浴中灭酶，随后在冰浴中迅速冷却，得到咸味增强肽。

7、进一步地，所述的一种转谷氨酰胺酶催化的咸味增强肽的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述罗非鱼鱼皮胶原以1:10的质量比溶解于去离子水中。

8、进一步地，步骤(1)中所述风味蛋白酶添加量为罗非鱼鱼皮胶原质量的1％。

9、进一步地，步骤(1)中所述风味蛋白酶水解温度为50℃。

10、进一步地，步骤(1)中所述风味蛋白酶水解时间为5h。

11、进一步地，步骤(1)中所述沸水浴灭酶时间为15min。

12、进一步地，步骤(1)中所述离心条件为10000r/min、10min。

13、进一步地，步骤(2)中所述超滤处理先使用5kda的超滤膜，获得分子量小于5kda的鱼皮胶原水解物组分，再使用1kda的超滤膜，获得分子量为1-5kda的鱼皮胶原水解物组分。

14、进一步地，步骤(3)中所述1-5kda的多肽粉末以1:20的质量比溶解于去离子水中。

15、进一步地，步骤(3)中所述以质量比为1:10(氨基葡萄糖：多肽)添加氨基葡萄糖。

16、进一步地，步骤(3)中所述转谷氨酰胺酶的酶浓度为多肽粉末质量的1.0％。

17、进一步地，步骤(3)中所述反应温度为37℃，所述反应时间为3h。

18、进一步地，步骤(3)中所述沸水浴灭酶时间为15min。

19、更进一步地，所述的一种转谷氨酰胺酶催化的咸味增强肽的制备方法获得咸味增强肽。

20、采用以上方案，本发明具有如下优点：

21、1、本发明以罗非鱼鱼皮胶原蛋白为原料，首先采用风味蛋白酶水解结合超滤技术制备1-5kda鱼皮胶原水解物并冷冻干燥成多肽粉末，通过优化反应条件，提高1-5kda鱼皮胶原水解物的产量；其次，通过向1-5kda的鱼皮胶原水解物中加入转谷氨酰胺酶和氨基葡萄糖，在优化后的条件下，借助酶法糖基化反应，以多肽为反应的酰基供体，氨基葡萄糖为酰基受体，制备咸味增强肽，相较于已报到的咸味增强肽(美拉德肽)的制备方法，本发明采用酶法糖基化反应原理制备咸味增强肽，反应条件更加温和(37℃)，无需高温制备，避免了具有毒性和致癌特性的美拉德反应产物的生成，反应产物的安全性更高。

22、2、本发明以罗非鱼鱼皮胶原为原料，实现罗非鱼加工副产物鱼皮的高值化，制备具有高附加值的咸味增强肽，为转谷氨酰胺酶催化的酶法糖基化反应提供理论基础，为制备以鱼皮胶原为原料的咸味增强肽产品提供参考。

23、3、本发明制备鱼皮胶原水解物的最佳反应条件为：50℃，1.0％风味蛋白酶，水解时间5h；转谷氨酰胺酶酶法糖基化的最佳反应条件为：37℃，ph7.0，酶浓度1.0％，糖基化反应时间3h。

24、4、本发明制备的样品具有显著的咸味增强效果，其咸味增强率为59.0％。此外，样品中氨基葡萄糖的导入量为26.9mg/g。

25、5、对酶法糖基化反应后的样品进行液相色谱质谱联用分析，鉴定了咸味增强肽的序列及糖基化位点。gln是主要的糖基化位点，一共鉴定出了15种胶原糖肽。

26、本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。

技术特征：

1.一种转谷氨酰胺酶催化的咸味增强肽的制备方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种转谷氨酰胺酶催化的咸味增强肽的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述罗非鱼鱼皮胶原以1:10的质量比溶解于去离子水中，风味蛋白酶添加量为罗非鱼鱼皮胶原质量的1％，风味蛋白酶水解温度为50℃，风味蛋白酶水解时间为5h。

3.根据权利要求1所述的一种转谷氨酰胺酶催化的咸味增强肽的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述沸水浴灭酶时间为15min，离心条件为10000r/min、10min。

4.根据权利要求1所述的一种转谷氨酰胺酶催化的咸味增强肽的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述超滤处理先使用5kda的超滤膜，获得分子量小于5kda的鱼皮胶原水解物组分，再使用1kda的超滤膜，获得分子量为1-5kda的鱼皮胶原水解物组分。

5.根据权利要求1所述的一种转谷氨酰胺酶催化的咸味增强肽的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述1-5kda的多肽粉末以1:20的质量比溶解于去离子水中，以质量比为1:10(氨基葡萄糖：多肽)添加氨基葡萄糖，转谷氨酰胺酶的酶浓度为多肽粉末质量的1.0％，反应温度为37℃，所述反应时间为3h。

6.根据权利要求1所述的一种转谷氨酰胺酶催化的咸味增强肽的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述沸水浴灭酶时间为15min。

7.根据权利要求1-2任一项所述的一种转谷氨酰胺酶催化的咸味增强肽的制备方法获得咸味增强肽。

技术总结
本发明公开了一种转谷氨酰胺酶催化的咸味增强肽的制备方法。在该制备方法中，风味蛋白酶酶解罗非鱼鱼皮胶原蛋白数小时，离心，取上清液得到鱼皮胶原水解物；鱼皮胶原水解物经过超滤得到1‑5kDa鱼皮胶原肽组分，冻干，获得1‑5kDa鱼皮胶原肽；37℃下，1‑5kDa鱼皮胶原肽与氨基葡萄糖以一定比例混合，在转谷氨酰胺酶催化下发生酶法糖基化反应，生成鱼皮胶原糖肽，冻干后得到鱼皮胶原糖肽产物。感官评价和电子舌分析结果显示，鱼皮胶原糖肽能显著提高0.2％NaCl溶液的咸味强度，具有明显增咸效果。相较于美拉德咸味增强肽，基于酶法糖基化的胶原糖肽的制备条件更加温和，具有更高的安全性，有望为食品工业“减盐不减咸”提供新思路。

技术研发人员：张宇昊,付余,过美红
受保护的技术使用者：西南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13