一种无标签野生型BKVVP1蛋白质的制备方法与流程

本发明属于生物，具体地涉及一种无标签野生型bkv vp1蛋白质的制备方法。

背景技术：

1、bk病毒(bk virus)，又名人多瘤病毒1(human polyomavirus 1)，是乙型多瘤病毒的成员，很少引起疾病，但通常与进行过肾移植的患者有关。由于器官移植患者术后长期应用免疫抑制剂，潜伏的bkv被激活，造成bkv尿症(bkv viruria)；随着病程进展，bkv持续复制，导致bkv血症(bkv viremia)；bkv在血液中持续高表达，进一步破坏移植肾组织，导致肾小管萎缩和间质纤维化，即bkv相关性肾病(bk virus nephropathy，bkvn)；bkvn已成为移植肾失去功能的重要原因之一。

2、bkv是具有5153个碱基对的环状基因组的无包膜双链dna病毒。基因组包装在直径约40至50纳米的病毒衣壳中，其形状为二十面体(t＝7对称)。衣壳由称为vp1的72个五聚体衣壳构成，能够自组装成封闭的二十面体；vp1的每个五聚体与另外两个衣壳蛋白之一vp2或vp3相关联。目前，bkv病毒的检测方法有很多种：如组织穿刺活检、尿液荧光定量pcr法检测、尿液decoy细胞检测等手段，但是这些检测手段专业性较强、操作麻烦、出结果时间较长等劣势导致器官移植的病人必须到医院才能够接受检测。试纸条式抗原抗体法检测就能够很好地满足病人居家就能够快速、准确且方便地检测，据居家检测结果，病人可以选择性地去医院进一步复查来确定是否需要调整免疫抑制剂的使用量、是否需要针对bkv病毒进一步治疗等。bkv vp1蛋白及抗体是现有bkv免疫检测的主要生物标志物，但因bkv vp1蛋白表达量极少且不易可溶性表达，市场上能够买到的抗体都是带有gst标签、sumo标签等的vp1蛋白质免疫动物获得的抗体，而这些标签都具有一定的免疫原性，免疫动物后所获得的的抗体特异性无法确定，导致检测特异性不佳。因此急需一种无标签野生型bkv vp1蛋白质的制备方法，以制备出无标签野生型bkv vp1蛋白质及抗体，提高bkv vp1免疫检测试剂的特异性。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种无标签野生型bkv vp1蛋白质的制备方法，以制备出无标签野生型bkv vp1蛋白质，以便后续免疫小鼠筛选获得仅对bkv vp1蛋白有抗性而对gst蛋白标签无抗性的抗体。

2、本发明公开了一种无标签野生型bkv vp1蛋白质的制备方法，包含下列步骤：

3、s1.克隆或合成获得含野生型bkv vp1序列的重组核酸片段；

4、s2.重组核酸片段和表达载体构建重组载体，将重组载体转化至宿主细胞，得到基因工程菌；

5、s3.发酵培养：所述基因工程菌活化后，进行扩大培养，再采用自诱导培养基进行发酵培养；

6、s4.蛋白纯化；

7、s5.酶切表达标签；

8、s6.分子筛纯化，收集无标签的野生型bkv vp1蛋白；

9、步骤s1中重组核酸片段含有his标签，其位于bkv vp1核酸序列的n端，且含有酶剪切位点的核酸序列，其位于his标签序列和bkv vp1核酸序列中间。

10、在一优选实施例中，所述重组核酸片段含有6x his和gst标签，其位于bkv vp1核酸序列的n端，以便于bkv vp1蛋白高可溶性表达和后期纯化中镍亲和层析的使用。

11、在一优选实施例中，所述重组核酸片段含有tev酶剪切位点的核酸序列，其位于his标签序列和bkv vp1核酸序列中间，以便于重组蛋白纯化后，通过tev酶剪his标签。

12、在一优选实施例中，所述重组核酸片段序列如seq id no.2所示。

13、在一优选实施例中，所述表达载体为pet-21a(+)、pet-24a(+)、pet-28a(+)、pet-30a(+)或pet-duet。

14、在一优选实施例中，所述宿主细胞为bl21(de3)或arcticexpress(de3)prare2bl21，其中优选为arcticexpress(de3)prare2 bl21。

15、在一优选实施例中，所述步骤s4中，所述蛋白纯化步骤：

16、a.菌体称重；

17、b.按照1g湿菌体加入50ml buffer a的量重悬菌体并使用均质机破碎细胞；

18、c.使用akta pure蛋白纯化仪和his trap hp预装柱纯化蛋白；

19、d.透析和超滤浓缩蛋白；

20、所用溶液如下：

21、裂解液：50mm kh2po4,300mm kcl,20mm咪唑,0.8m尿素,ph8.0；

22、洗脱液：50mm kh2po4,300mm kcl,500mm咪唑,0.8m尿素,ph8.0；

23、透析液：50mm kh2po4,300mm kcl,1mm dtt,0.8m尿素,1mm edta,1mm pmsf,ph8.0。

24、在一优选实施例中，所述步骤s5酶切表达标签条件为：步骤s4说收集的目的蛋白经将咪唑透析至1mm以下，加入tev酶，4℃酶切过夜。

25、在一优选实施例中，所述步骤s6分子筛纯化，所用分子筛柱为可分离10kd-100kd蛋白的分子筛柱，优选为hiprep 26/60sephacryl s-300hr。

26、另一方面，本发明还包含上述制备方法所获得的无标签野生型bkv vp1蛋白。

27、本发明所述方法能够高效的表达带有6x his和gst标签的bkv vp1蛋白，通过tev酶剪切能够将多余的标签切除,每升自诱导培养基可收获纯度达90％以上的蛋白10mg以上，能够获得仅对bkv vp1蛋白有结合活力对gst、6x his标签无结合活力的抗体，为后续bkv poct式抗原抗体检测试剂盒提供关键的原料抗体。

技术特征：

1.一种无标签野生型bkv vp1蛋白质的制备方法，其特征在于，包含下列步骤：

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤s1中所述重组核酸片段含有6x his和gst标签，其位于bkv vp1核酸序列的n端。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤s2中所述重组核酸片段含有tev酶剪切位点的核酸序列，其位于his标签序列和bkv vp1核酸序列中间。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤s2中所述表达载体为pet-21a(+)、pet-24a(+)、pet-28a(+)、pet-30a(+)或pet-duet。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤s2中所述宿主细胞为bl21(de3)或arcticexpress(de3)prare2 bl21。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤s4中，所述蛋白纯化步骤：

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤s5酶切表达标签条件为：步骤s4说收集的目的蛋白经将咪唑透析至1mm以下，加入tev酶，4℃酶切过夜。

8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤s6分子筛纯化，所用分子筛柱为可分离10kd～100kd蛋白的分子筛柱。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述分子筛柱为hiprep26/60sephacryls-300hr。

10.权利要求1-9所述制备方法而制备的无标签野生型bkv vp1蛋白质。

技术总结
本发明属于生物技术领域，更具体地涉及一种无标签野生型BKV VP1蛋白质的制备方法。本发明公开了一种无标签野生型BKV VP1蛋白质的制备方法，能够高效的表达带有6x His和GST标签的BKV VP1蛋白，通过TEV酶剪切能够将多余的标签切除,每升自诱导培养基可收获纯度达90％以上的蛋白10mg以上，能够获得仅对BKV VP1蛋白有结合活力对GST、6x His标签无结合活力的抗体，为后续BKV POCT式抗原抗体检测试剂盒提供关键的原料抗体。

技术研发人员：周超强,林巍靖
受保护的技术使用者：上海健耕医药科技股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15