一种基于棘孢木霉菌的生物纤维素膜及其制备方法和应用与流程

本发明涉及微生物发酵工程领域，具体涉及一种基于棘孢木霉菌的生物纤维素膜及其制备方法和应用。

背景技术：

1、纤维素是地球上最为丰富的天然聚合物。生物纤维素(bacterial cellulose，bc)是由微生物经生物合成所分泌的纤维素类物质的统称，通常是通过体外酶促合成或由藻类、真菌和细菌等微生物合成。生物纤维素膜，作为一种新型的生物纳米纤维膜材料，具有较高的机械强度和亲水能力，同时具备较强的持水性和较好的生物相容性等优异性能，已被广泛应用于食品、医药、环保等领域。

2、生物纤维素膜通常是在不同培养条件下，由醋酸杆菌属(gluconacetobacter)、根瘤菌属(rhizobium)、假单胞菌属(pseudomonas)、沙门氏菌属(salmonella)和八叠球菌属(sarcina)等中的某种微生物通过动态或静态发酵产生，其中木葡糖酸醋杆菌为典型代表。基于上述菌种制备生物纤维素膜，仍存在菌种单一、生产速率较低等问题。因此，探寻新型菌种或开发混合菌种以提高生物纤维素膜的生产效率、降低生产成本是目前的研究热点。通过微生物发酵工程获取生物纤维素膜是一个复杂的生物学过程，并且生物纤维素膜产量受多种混合因素的影响，如生产菌种、培养方式等，选择合适的生产菌种并结合合适的培养方法对于缩短培养周期、提高纤维素膜产量具有重要意义。

3、专利cn112760265 a公布了一种利用木葡糖酸醋杆菌171027-per1动态发酵培养细菌纤维素的方法，其中以含蔗糖的培养液作为发酵原料，将木葡糖酸醋杆菌进行动态培养所得的生物纤维素产量较高，所获纤维素较细，提供了一种适合动态培养的细菌纤维素菌株。

4、专利cn 103923865 a公开了一种通过深层动态与浅层静态交替进行发酵培养纤维素的方法，所用菌种为木葡糖酸醋杆菌bc13，采用深层动态与浅层静态进行发酵的方式不会形成块状或球形的生物纤维素，所得产物为膜片状的细菌纤维素。

5、以上方法虽然能够通过发酵生产得到生物纤维素，但通过动态培养容易获得球状、絮状的纤维素，均匀成膜难度较大，得到的多为生物纤维素粉末；若通过动静态结合的方法进行发酵生产则工艺复杂、成本较高，因此静态培养方法仍是目前获得膜片状生物纤维素的较适宜方法。但适合制备纤维素的菌种仍然需要探索，均匀、形状可控而成本低廉的纤维素膜的制备也是市场的急切需求的。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术中细菌发酵制备细胞纤维素成膜难度大，形状不可控的问题，提供一种以棘孢木霉菌种进行生物纤维素膜的发酵生产方法，采用静态培养的方式进行生物纤维素膜的培养，所产纤维素膜均匀、形状可控，所用方法简便易行，成本低廉，易于大规模培养。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

3、一种基于棘孢木霉菌的生物纤维素膜的制备方法，包括步骤：

4、步骤1，配制用于制备生物纤维素膜的培养液，并进行灭菌处理；

5、步骤2，在灭菌后的培养液中接种生产菌种；

6、步骤3，将接种菌种的培养液静态恒温培养，发酵制得生物纤维素膜；

7、步骤4，将生物纤维素膜洗涤、干燥得到生物纤维素膜成品；

8、所述生产菌种为棘孢木霉(trichoderma asperellum)，命名为rpt1，于2022年12月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为cctcc no:m20221879。

9、本发明以棘孢木霉为生产菌种，通过静态恒温培养，可得到完整、均匀的生物纤维素膜成品，生物纤维素膜的形状和尺寸可根据培养皿的形状和尺寸调整。其原因可能为容器与外界接触表面给真菌提供充足的氧气，真菌倾向于在培养液与空气接触界面生长。因此可通过使用不用形状和尺寸的培养皿来获得不同形状和尺寸的生物纤维素膜。同时得到的生物纤维素膜成品产量好，孔隙率高，各项性能优异。

10、优选地，步骤1中灭菌处理采用高温高压灭菌处理，如在压力蒸汽灭菌锅中100-150℃灭菌10-30min。

11、步骤1中培养液的原料组成为：葡萄糖10-20g，酵母提取物5-15g，蛋白胨5-10g，磷酸二氢钾1.5-3g，去离子水1000ml。该培养液能够快速发酵制得生物纤维素膜，所制得的生物纤维素膜厚度均匀，尺寸可调。

12、所述培养液的ph为5.5-7.5。采用氢氧化钠、柠檬酸或乙酸等常规酸碱调剂调节培养液的ph值。在培养液中添加柠檬酸、乙酸可以促进葡萄糖转化为纤维素，但过高的柠檬酸或乙酸含量可能会促进棘孢木霉菌孢子的产生，降低纤维素的产量。本发明中弱碱性的环境有利于棘孢木霉菌的菌丝生长，促进生物纤维素膜的形成。

13、步骤2中生产菌种的接种率为10-30％。

14、所述生物纤维素膜的尺寸通过盛装培养液进行恒温培养的容器控制。

15、步骤3中恒温培养的温度范围为20-37℃，培养3-8天。优选地，培养温度范围为25-37℃。

16、优选地，步骤4中清洗的步骤包括：将生物纤维素膜取出后用蒸馏水洗涤、再加入氢氧化钠溶液浸泡，再用去离子水反复冲洗至溶液ph为中性。

17、优选地，氢氧化钠溶液的浓度为0.1-0.2mol/l，浸泡温度为80-100℃，洗涤时间60-120min，以除去残存的菌体和培养液。

18、优选地，所述干燥采用冷冻干燥。

19、根据上述方法制备的生物纤维素膜的产量约为8-12g/l，膜厚度约为2-3mm。在一些实施方式中，产量约为8.89-10.02g/l，

20、本发明还提供根据所述的制备方法制得的生物纤维素膜，所述生物纤维素膜的孔隙率约为60-80％，吸液量约为2-5g/g，水蒸气透过率约为900-1000g/m2/d。本发明还提供所述的生物纤维素膜在生物医学领域中的应用。

21、在一些实施方式中，所述生物纤维素膜的孔隙率约为60-80％。

22、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

23、本发明提供一种棘孢木霉菌制备生物纤维素膜的方法，能够得到均匀、完整的整片膜结构的纤维素，一方面拓宽了生产生物纤维素膜的菌种可选择面，同时生物纤维素膜的形状可控，制备方法具有操作简单、效率高、成本低、原料易得等优点，在生物纤维素膜的生产技术领域中具有推广应用价值。

技术特征：

1.一种基于棘孢木霉菌的生物纤维素膜的制备方法，其特征在于，包括步骤：

2.根据权利要求1所述的基于棘孢木霉菌的生物纤维素膜的制备方法，其特征在于，步骤1中培养液的原料组成为：葡萄糖10-20g，酵母提取物5-15g，蛋白胨5-10g，磷酸二氢钾1.5-3g，去离子水1000ml。

3.根据权利要求1所述的基于棘孢木霉菌的生物纤维素膜的制备方法，其特征在于，所述培养液的ph为5.5-7.5。

4.根据权利要求1所述的基于棘孢木霉菌的生物纤维素膜的制备方法，其特征在于，步骤2中生产菌种的接种率为10-30％。

5.根据权利要求1所述的基于棘孢木霉菌的生物纤维素膜的制备方法，其特征在于，所述生物纤维素膜的尺寸通过盛装培养液进行恒温培养的容器控制。

6.根据权利要求1所述的基于棘孢木霉菌的生物纤维素膜的制备方法，其特征在于，步骤3中恒温培养的温度范围为20-37℃，培养3-8天。

7.根据权利要求1所述的基于棘孢木霉菌的生物纤维素膜的制备方法，其特征在于，所述生物纤维素膜的产量为8-12g/l。

8.根据权利要求1-7任一项所述的制备方法制得的生物纤维素膜。

9.根据权利要求8所述的生物纤维素膜，其特征在于，所述生物纤维素膜的孔隙率约为60-80％，吸液量约为2-5g/g，水蒸气透过率约为900-1000g/m2/d。

10.根据权利要求8所述的生物纤维素膜在生物医学领域中的应用。

技术总结
本发明涉及微生物发酵工程领域，具体公开一种基于棘孢木霉菌的生物纤维素膜及其制备方法和应用。包括步骤：以棘孢木霉(Trichoderma asperellum)静态恒温培养方式制备生物纤维素膜；所制备的生物纤维素膜，形状可控，制备效率高，产量好，纤维素膜的各项性能优异，在生物纤维素膜的生产与应用领域具有推广应用价值。且该生物纤维素膜具有促进细胞增殖和迁移的能力，可将其应用于面膜、创伤敷料、人造皮肤等医用材料领域。

技术研发人员：冯嫩妙
受保护的技术使用者：宁波一德益生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15