利用环境DNA检测鉴定水域中鮻物种的检测方法与流程

本发明属于分子生态学，具体涉及利用环境dna检测鉴定水域中鮻物种的检测方法。

背景技术：

1、鮻(planilizahaematocheilus)也称为梭鱼，隶属鲻形目、鲻科，是典型的半洄游性鱼类，一般在海水里产卵越冬，在江河或河口育肥。

2、环境dna(environmentaldna.edna)是指生物体经由体表、尿液、粪便、黏液等生物体碎片释放到环境中的dna片段，作为一种新的物种检测方式，可从各种环境样本例如水、土壤或冰中获得。edna技术可以检测到物种的任何生命阶段，包括卵，幼体，或成体，具有保护性、灵敏性和准确性等特点，此外edna检测还能为采样人员提供更安全、更有利的调查条件，减少对专业野外设备的依赖，从而改善对物种的监测条件，目前，edna已被广泛用于检测入侵和濒危物种、测定物种多样性、估测物种生物量等研究方面。

3、近年来，随着捕捞强度不断加大，导致鮻的食物链遭受到破坏，使鮻资源处于严重衰退状态，所以对国内各水域适宜鮻生长的海域中鮻进行生态调查是十分必要的。目前，对于鮻的检测主要依赖于捕捞法，即通过对水体中的物种进行捕捞，进而确定物种种类。捕捞法存在许多弊端，包括工作强度高、准确性低，生态环境危害大等诸多问题。因此，需要一种工作强度低、准确度高且对生态环境危害小的对水域中鮻物种的鉴定检测方法。

技术实现思路

1、为解决现有技术中对于鮻物种的鉴定检测方法存在工作强度高、准确性低且生态环境危害大的问题，本发明根据鮻线粒体基因组序列，通过设计鮻的分子标记位点和引物，提供了一种利用环境dna检测鉴定水域中鮻物种的检测方法来实现对水域鮻的生态调查。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、利用环境dna检测鉴定水域中鮻物种的检测方法，包括如下步骤：

4、s1、采集待测水域的水样，滤膜过滤，收集滤膜上的物料备用；

5、s2、提取滤膜上的物料edna；

6、s3、以上述s2提取的edna为模板，进行两轮pcr扩增，得到pcr扩增产物；

7、s4、将上述s3得到的pcr扩增产物用电泳检测，阳性条带进行edna片段测序，得到的edna片段序列与用于鉴定鮻物种的dna分子标记位点序列进行比对，98-100％匹配为鮻物种。

8、优选地，s4中，用于鉴定鮻物种的dna分子标记位点，其dna序列如seq id no.1所示。

9、优选地，s3中，第一轮pcr扩增的上游引物为ph-mt-f1，其序列如seq id no.2所示，下游引物为ph-mt-r1，其序列如seq id no.3所示；将第一轮pcr扩增得到的第一轮pcr产物作为模板进行第二轮pcr扩增，得到pcr扩增产物；

10、第二轮pcr扩增的上游引物为ph-mt-f2，其序列如seq id no.4所示，下游引物为ph-mt-r2，其序列如seq id no.5所示。

11、优选地，s3中，所述pcr扩增的50μl反应体系包括：

12、第一轮pcr扩增：edna模板3μl，extaq0.25μl，10×extaqbuffer5μl，dntpmixture4μl，10μm上下游引物各1μl，超纯水补足35.75μl；

13、第二轮pcr扩增：第一轮pcr产物1μl，extaq0.25μl，10×extaqbuffer5μl，dntpmixture4μl，10μm上下游引物各1μl，超纯水补足37.75μl。

14、优选地，s3中，所述pcr扩增的反应条件为：

15、第一轮pcr扩增：95℃，8min/95℃，30s→60℃，30s→72℃，1min/72℃，8min，共50个循环；

16、第二轮pcr扩增：94℃，3min/94℃，10s→59℃，30s→72℃，1min/72℃，7min，共50个循环。

17、优选地，s1中，采集的水样经直径为47mm，孔径为0.22μm的滤膜进行过滤。

18、优选地，过滤后的滤膜于80℃冷冻保存备用。

19、优选地，s2中，利用试剂盒提取滤膜上的edna，提取的edna于–80℃冷冻保存。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

20、本发明提供了一种利用环境dna检测鉴定水域中鮻物种的检测方法，该方法是一种快速检测水体中的鮻的方法，该检测方法仅从水体中采集水样，即可实现对鮻物种的检测，具有对生态系统造成的破坏性小，结果准确性高的优点，为鮻物种追踪及保护提供了有效途径。

技术特征：

1.利用环境dna检测鉴定水域中鮻物种的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的利用环境dna检测鉴定水域中鮻物种的检测方法，其特征在于，s4中，用于鉴定鮻物种的dna分子标记位点，其dna序列如seq id no.1所示。

3.根据权利要求2所述的利用环境dna检测鉴定水域中鮻物种的检测方法，其特征在于，s3中，第一轮pcr扩增的上游引物为ph-mt-f1，其序列如seq id no.2所示，下游引物为ph-mt-r1，其序列如seq id no.3所示；将第一轮pcr扩增得到的第一轮pcr产物作为模板进行第二轮pcr扩增，得到pcr扩增产物；

4.根据权利要求1所述的利用环境dna检测鉴定水域中鮻物种的检测方法，其特征在于，s3中，所述pcr扩增的50μl反应体系包括：

5.根据权利要求1所述的利用环境dna检测鉴定水域中鮻物种的检测方法，其特征在于，s3中，所述pcr扩增的反应条件为：

6.根据权利要求1所述的利用环境dna检测鉴定水域中鮻物种的检测方法，其特征在于，s1中，采集的水样经直径为47mm，孔径为0.22μm的滤膜进行过滤。

7.根据权利要求7所述的利用环境dna检测鉴定水域中鮻物种的检测方法，其特征在于，过滤后的滤膜于80℃冷冻保存备用。

8.根据权利要求1所述的利用环境dna检测鉴定水域中鮻物种的检测方法，其特征在于，s2中，利用试剂盒提取滤膜上的edna，提取的edna于–80℃冷冻保存。

技术总结
本发明属于分子生态学技术领域，具体涉及利用环境DNA检测鉴定水域中鮻物种的检测方法，包括如下步骤：S1、采集待测水域的水样，滤膜过滤，收集滤膜上的物料备用；S2、提取滤膜上的物料eDNA；S3、以上述S2提取的eDNA为模板，进行两轮PCR扩增，得到PCR扩增产物；S4、将上述S3得到的PCR扩增产物用电泳检测，阳性条带进行eDNA片段测序，得到的eDNA片段序列与用于鉴定鮻物种的DNA分子标记位点序列进行比对，98‑100％匹配为鮻物种。本发明提供的检测方法仅从水体中采集水样，即可实现对鮻物种的检测，具有对生态系统造成的破坏性小，结果准确性高的优点，为鮻物种追踪及保护提供了有效途径。

技术研发人员：朱春月,杨培民,胡宗云,张健,张伯序,刘忠航
受保护的技术使用者：辽宁省淡水水产科学研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15