本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种提高l-丙氨酸发酵生产效率的新方法。
背景技术：
1、l-丙氨酸，是一种人体非必须氨基酸，近年来在日化、医药和食品等领域都有着广泛的应用，渐渐受到科研人员的关注。
2、生物法合成l-丙氨酸由于绿色环保、节能减碳，更具有生产优势。生物法主要包括酶法和微生物发酵法，其中酶法合成l-丙氨酸的原料富马酸价格较高，且富马酸源自不可再生石油资源，因此，生产成本较高，而微生物发酵法生产l-丙氨酸是以可再生葡萄糖为原料，成本价格相对低廉，且工艺能耗低，已成为当前的丙氨酸主流生产方式。
3、丙氨酸发酵过程中需要一定的还原力，现有技术中，通常会因还原力不足或其他原因限制丙氨酸的发酵水平。因此，如何提高l-丙氨酸的发酵生产效率，渐渐成为研究的热点。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种提高l-丙氨酸发酵生产效率的新方法，采用两阶段发酵，先好氧阶段培养菌株，再厌氧发酵产l-丙氨酸，厌氧发酵阶段中采用含葡萄糖和还原型碳源的复合碳源，并同时加入适量的辅因子，进而可以提高l-丙氨酸的发酵产量和转化率。
2、为达到上述发明目的，解决技术问题，本发明提供一种提高l-丙氨酸发酵生产效率的新方法，主要包括以下步骤：
3、(1).一级种子培养：将低温保藏的菌株进行活化培养。
4、(2).二级种子扩培：按照一定接种量，将步骤(1)中活化好的菌株种子接至二级种子培养基中，进行扩大培养。
5、(3).发酵培养：将步骤(2)培养好的种子液接种至发酵培养基中，控制合适的发酵条件，进行l-丙氨酸发酵。
6、本发明中，在一个具体的实施方案中，步骤(1)中所述的菌株选自大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、德氏乳杆菌等中的任一种或几种，优选大肠杆菌；
7、步骤(1)所述一级种子培养可以采用本领域的常规方法，例如，取低温保藏的菌株于装有lb培养基的容器中，在100～200rpm、30～40℃条件下进行活化培养，od600在2.5～5之间表示生长成熟；其中，菌株与lb培养基的体积比为0.2％～5％；
8、在一个具体的实施方案中，优选地，步骤(1)所述一级种子培养的方法为：取0～1ml甘油管菌种(-20℃保存)于装有50～100ml lb培养基的500ml三角瓶中，在往复式摇床中100～200rpm、30～40℃培养8～9h左右，od600在2.5～5之间表示生长成熟。
9、本发明中，步骤(2)所述二级种子扩培，是将步骤(1)中活化好的种子液按照1％～10％的接种量接种至装有二级种子培养基的容器中，30～40℃恒温培养，od600在5～10之间表示生长成熟；
10、在一个具体的实施方案中，优选地，步骤(2)的种子扩培过程包括：将步骤(1)中活化好的种子液，按照1％～10％的接种量接种至装有50～100ml二级种子培养基的500ml三角瓶中，30～40℃恒温培养15～20h，od600在5～10之间表示生长成熟；
11、更优选地，所述种子培养基配方为：葡萄糖1～10g/l、氯化铵1～10g/l、酵母浸粉0.1～5g/l、蛋白胨1～10g/l、磷酸氢二钾1～10g/l、七水硫酸镁0.1～10g/l、硫酸亚铁0.1～10g/l、硫酸锰0.1～5g/l、硫酸铜0.1～5g/l。
12、本发明中，步骤(3)所述发酵培养，是将步骤(2)培养好的种子液按照1～10％接种量接种至发酵培养基中进行发酵培养，控制发酵条件，采用好氧-厌氧两阶段发酵，好氧阶段溶氧控制20％～40％，碳源仅添加葡萄糖，菌株od生长至10～30，转至厌氧阶段，碳源采用含葡萄糖和还原型碳源的复合碳源，同时添加一定量的辅因子，发酵，至葡萄糖不再消耗，发酵结束；
13、在一个具体的实施方案中，优选地，步骤(3)的发酵培养制备过程为：准备发酵罐，将步骤(2)中培养成熟的种子按照1～10％接种量，接入至无菌发酵培养基中，发酵温度30～45℃，发酵ph6.5～7.0，罐压0.01～0.1mpa，采用好氧-厌氧两阶段发酵，好氧阶段风量控制1～30l/min，溶氧控制20％～40％，转速50～600rpm，碳源仅添加葡萄糖10～30g/l，菌株od生长至10～30，转至厌氧阶段，停止通风，风量调整为0，搅拌转速调整为100～200rpm，厌氧阶段碳源采用含葡萄糖和还原型碳源的复合碳源100～150g/l，同时添加0.05～1g/l的辅因子，发酵24～48小时，此时葡萄糖不再消耗，发酵结束；
14、更优选地，所述发酵培养基配方为葡萄糖10～80g/l、玉米浆5～20g/l、氯化铵1～10g/l、磷酸氢二钾0.1～10g/l、磷酸二氢钾0.1～10g/l、七水硫酸镁0.1～5g/l、硫酸亚铁0.01～5g/l、硫酸锰0.01～1g/l、氯化锌0.1～1g/l、硫酸铜0.1～5g/l，溶剂为水，ph 6.8～7.2；
15、所述还原型碳源选自甘露醇、山梨醇、甲醇中的至少一种，优选为山梨醇或甘露醇，更优选为山梨醇；优选地，葡萄糖:还原型碳源(质量比)＝2:1～40:1，更优选5:1～20:1；
16、所述辅因子选自谷氨酸、联苄吡啶、硫辛酸、焦磷酸、中性红等中的至少一种，优选联苄吡啶。
17、本发明提供的一种提高l-丙氨酸发酵产量的新方法，与现有的技术相比，所取得的积极效果如下：
18、(1)提高l-丙氨酸发酵生产效率：能够将l-丙氨酸的发酵产量由初始的75g/l提高至98g/l，转化率由75％提高至98％，产酸速率由1.5g/l/h提高至3.3g/l/h；
19、(2)便于操作：工艺操作简单，易于实现工业化放大。
1.一种提高l-丙氨酸发酵生产效率的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的菌株选自大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、德氏乳杆菌中的任一种或几种，优选大肠杆菌。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中一级种子培养的步骤为：取低温保藏的菌株于装有lb培养基的容器中，在100～200rpm、30～40℃条件下进行活化培养，od600在2.5～5之间表示生长成熟；其中，优选的，菌株与lb培养基的体积比为0.2％～5％。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)的操作步骤为：将步骤(1)中活化好的种子液按照1％～10％的接种量接种至装有二级种子培养基的容器中，30～40℃培养，od600在5～10之间表示生长成熟。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)种子培养基配方为：葡萄糖1～10g/l、氯化铵1～10g/l、酵母浸粉0.1～5g/l、蛋白胨1～10g/l、磷酸氢二钾1～10g/l、七水硫酸镁0.1～10g/l、硫酸亚铁0.1～10g/l、硫酸锰0.1～5g/l、硫酸铜0.1～5g/l。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述发酵培养基配方为：葡萄糖10～80g/l、玉米浆5～20g/l、氯化铵1～10g/l、磷酸氢二钾0.1～10g/l、磷酸二氢钾0.1～10g/l、七水硫酸镁0.1～5g/l、硫酸亚铁0.01～5g/l、硫酸锰0.01～1g/l、氯化锌0.1～1g/l、硫酸铜0.1～5g/l，溶剂为水，ph6.8～7.2。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，发酵温度30～45℃，发酵ph6.5～7.0，罐压0.01～0.1mpa。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，好氧阶段风量控制1～30l/min，溶氧控制20％～40％，转速50～600rpm，碳源仅添加葡萄糖10～30g/l。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，厌氧阶段风量调整为0，搅拌转速调整为100～200rpm；复合碳源100～150g/l，优选的，所述还原型碳源选自甘露醇、山梨醇、甲醇中的至少一种，优选为山梨醇或甘露醇，更优选为山梨醇；更优选地，葡萄糖:还原型碳源质量比＝2:1～40:1，更优选5:1～20:1。
10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，添加0.05～1g/l的辅因子，优选的，所述辅因子选自谷氨酸、联苄吡啶、硫辛酸、焦磷酸、中性红中的至少一种，优选联苄吡啶。