一种无氮产胶发酵生产可得然胶的方法与流程

本发明涉及微生物多糖发酵，尤其涉及一种无氮产胶发酵生产可得然胶的方法。

背景技术：

1、可得然胶(curdlan)，又称热凝胶，凝结多糖，是由土壤杆菌属(agrobacteriumbiovar1)细菌粪产碱杆菌(a.faecalis var.)或放射性土壤杆菌(a.radiobacter)为产生菌。可得然胶是以β-1，3-糖苷键构成的水不溶性葡聚糖，分子式为(c6h10o5)n，n>250(400-500)。可得然胶是一类将其悬浊液加热后，既能形成硬而有弹性的热不可逆性凝胶，又能形成热可逆性凝胶的多糖类的总称。1996年12月，美国食品与药物管理局fda批淮并允许可得然胶作为一种直接的添加剂用于食品行业。可得然胶因此成为继黄原胶、结冷胶之后第三个经fda批准的发酵生产的食品用多糖，这为可得然胶的进一步推广应用提供了更为广阔的空间。目前，可得然胶作为食品添加剂具有广泛的应用，在作为凝胶剂、结构改性剂、增稠剂、稳定剂等广泛应用于鱼糜制品、肉制品、米面制品、仿生素食制品等的制作中。它同时具有抗冻融性、包油性、抗脱水性、抗热稳定性。

2、目前公开了几种生产可得然胶的方法，其中cn108103121a是在发酵培养中采用控制ph值、分次补充碳源和添加非离子表面活性剂的工艺进行发酵培养条件的控制，用于缩短发酵周期。cn106701885a是在发酵培养基中加入可溶性多糖类发酵促进剂，通过阶段性控制转速来提高得率。现有技术需要加入额外的试剂来提高可得然胶的产量，增加了企业的成本。

3、可得然胶主发酵分为两个阶段：第一阶段为在有氮源、ph为7.0左右条件下进行菌体生长培养；第二阶段为当氮源耗尽之后、调整ph到5.6左右继续发酵产胶。但是在第一阶菌体生长期段时，会存在氮源不能被充分消耗的问题，导致不能过渡到第二阶段、不能产可得然胶、生产失败。

技术实现思路

1、(一)要解决的技术问题

2、鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种无氮产胶发酵生产可得然胶的方法，其解决了发酵生产可得然胶时，由于发酵第一阶段氮源未被充分消耗导致过渡到第二阶段失败，不能产可得然胶的技术问题。

3、(二)技术方案

4、为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

5、本发明实施例提供一种无氮产胶发酵生产可得然胶的方法，包括如下步骤：

6、将产可得然胶的菌株种子培养液接入含有氮源的发酵培养基中，进行第一阶段的菌体培养；菌体培养结束后，将发酵液和菌体分离，将分离出的不含氮的菌体接入到不含氮源的发酵培养基中，进行第二阶段的产胶发酵，产胶发酵结束后，经后处理，得到可得然胶。

7、可选地，第一阶段的菌体培养的培养条件为：接种量为体积计0.1-2％，培养温度为25-35℃，ph为6.0-8.0，通风0.2-2vvm，搅拌速度为100-1000rpm，培养od660到4.0-9.0，培养时间为8-24小时。

8、优选地，培养od660到6.0-9.0。

9、可选地，所述含有氮源的发酵培养基包括如下质量百分比的组分：碳源2-6％，氮源0.2-1.2％，k2hpo4 0.05-0.2％，mgso4·7h2o 0.05-0.2％，fecl3 0.001-0.002％，zncl20.001-0.002％，消泡剂0.05-0.07％，其余为水；

10、所述不含氮源的发酵培养基包括如下质量百分比的组分：碳源3-10％，k2hpo40.05-0.2％，mgso4·7h2o 0.05-0.2％，fecl3 0.001-0.002％，zncl20.001-0.002％，消泡剂0.05-0.07％，其余为水。

11、可选地，所述氮源为(nh4)2hpo4或酵母粉中的至少一种；在所述含有氮源的发酵培养基中，(nh4)2hpo4的添加量为0.2-0.5wt％，酵母粉的添加量为0.6-1.2wt％。

12、可选地，分离出的含氮培养基，经过组分检测，灭菌，调整营养成分后，可循环用于菌株发酵和生产可得然胶。

13、可选地，所述碳源包括葡萄糖，所述水包括去离子水。

14、可选地，所述分离的方法包括无菌离心或无菌过滤，无菌离心的转速为1000g-20000g，离心时间为5-60分钟。

15、可选地，第二阶段的产胶发酵的培养条件为：温度为25-35℃，ph为5.2-5.8，通风0.2-2vvm，搅拌速度为100-1000rpm，培养时间为40-120小时。

16、可选地，所述后处理包括：

17、(1)碱液溶解：用碱调发酵液ph至11.0-13.0，搅拌溶解后，1000g-20000g离心1-20分钟，收集上清液；

18、(2)酸沉淀：向上清液中加入酸，调节ph至6.0-7.0，搅拌沉淀后，1000g-20000g离心1-20分钟，收集沉淀；

19、(3)洗涤、脱水：加入酒精溶液，搅拌洗涤脱水30-40分钟，1000g-20000g离心1-20分钟，收集沉淀；

20、(4)干燥、粉碎。

21、可选地，所述碱包括氢氧化钠，所述酸包括盐酸。

22、(三)有益效果

23、本发明的有益效果是：

24、鉴于现有技术发酵生产可得然胶的过程中，主发酵第一阶段(菌体培养)的氮源经常不能被充分耗尽，较难自然过渡到主发酵第二阶段(产胶阶段)，导致不能产可得然胶，造成很大的浪费和生产成本的大幅提升，同时由于培养基中大量营养成分如糖等不能被消耗，只能排放到污水处理系统中，导致污水池负荷过载等技术问题，本发明提供了一种无氮产胶发酵生产可得然胶的方法。本发明通过将主发酵第一阶段(菌体培养)的发酵液进行无菌离心，将菌体和含氮源的培养基分离，之后将不含氮源的菌体加入到主发酵第二阶段(产胶阶段)的不含氮源的培养基中进行无氮发酵，在特定的培养条件和离心条件下，使第二阶段的发酵能顺利产可得然胶。

25、其第一阶段在含氮培养基(全营养成分)的条件下，可提供菌株正常生命活动所需要的全部营养成分，使菌株能够在短时间内快速增殖到高细胞密度，以获得大量处于对数期的产可得然胶发酵菌细胞；然后将大量的产可得然胶发酵菌细胞从含氮培养基中采用离心方式分离出来，转入第二阶段的无氮培养基中进一步培养，在无氮条件下胁迫菌株产生可得然胶。一方面可以提高产可得然胶的效率，避免第二阶段中含氮而阻碍菌株生产可得然胶；另一方面，第一阶段离心后的培养基经灭菌，成分调整后还能进一步回用于第一阶段，大大提高营养成分的利用率，减少了污水排放。

26、本发明无需另外添加其他促进发酵产胶的成分，企业无需为购买额外试剂耗资。本发明既可以实现高可得然胶产量，又降低了污水处理成本。本发明方法主发酵时产胶的成功率高、操作方便、主发酵的培养基选择范围广，应用前景广阔。

技术特征：

1.一种无氮产胶发酵生产可得然胶的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的无氮产胶发酵生产可得然胶的方法，其特征在于，第一阶段的菌体培养的培养条件为：接种量为体积计0.1-2％，培养温度为25-35℃，ph为6.0-8.0，通风0.2-2vvm，搅拌速度为100-1000rpm，培养od660到4.0-9.0，培养时间为8-24小时。

3.根据权利要求1所述的无氮产胶发酵生产可得然胶的方法，其特征在于，所述含有氮源的发酵培养基包括如下质量百分比的组分：碳源2-6％，氮源0.2-1.2％，k2hpo40.05-0.2％，mgso4·7h2o0.05-0.2％，fecl30.001-0.002％，zncl20.001-0.002％，消泡剂0.05-0.07％，其余为水；

4.根据权利要求3所述的无氮产胶发酵生产可得然胶的方法，其特征在于，所述氮源为(nh4)2hpo4或酵母粉中的至少一种；在所述含有氮源的发酵培养基中，(nh4)2hpo4的添加量为0.2-0.5wt％，酵母粉的添加量为0.6-1.2wt％。

5.根据权利要求3所述的无氮产胶发酵生产可得然胶的方法，其特征在于，所述碳源包括葡萄糖，所述水包括去离子水。

6.根据权利要求1所述的无氮产胶发酵生产可得然胶的方法，其特征在于，所述分离的方法包括无菌离心或无菌过滤，无菌离心的转速为1000g-20000g，离心时间为5-60分钟。

7.根据权利要求1所述的无氮产胶发酵生产可得然胶的方法，其特征在于，分离出的含氮培养基，经过组分检测，灭菌，调整营养成分后，可循环用于菌株发酵和生产可得然胶。

8.根据权利要求1所述的无氮产胶发酵生产可得然胶的方法，其特征在于，第二阶段的产胶发酵的培养条件为：温度为25-35℃，ph为5.2-5.8，通风0.2-2vvm，搅拌速度为100-1000rpm，培养时间为40-120小时。

9.根据权利要求1所述的无氮产胶发酵生产可得然胶的方法，其特征在于，所述后处理包括：

10.根据权利要求9所述的无氮产胶发酵生产可得然胶的方法，其特征在于，所述碱包括氢氧化钠，所述酸包括盐酸。

技术总结
本发明涉及一种无氮产胶发酵生产可得然胶的方法，属于微生物多糖发酵技术领域。包括如下工艺步骤：将产可得然胶的菌株种子培养液接入含有氮源的发酵培养基中，进行第一阶段的菌体培养；菌体培养结束后，将发酵液和菌体分离，将分离出的不含氮的菌体接入到不含氮源的发酵培养基中，进行第二阶段的产胶发酵，产胶发酵结束后，经后处理，得到可得然胶。本发明方法主发酵时产胶的成功率高、操作方便、主发酵的培养基选择范围广。

技术研发人员：罗枭,王黎
受保护的技术使用者：嘉保生物科技（保山）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15