高通量筛选L-苏氨酸转醛酶突变体高效合成β-羟基-α-氨基酸

本发明涉及高通量筛选l-苏氨酸转醛酶突变体高效合成β-羟基-α-氨基酸，属于生物催化工程领域。

背景技术：

1、β-羟基-α-氨基酸(βhaas)是一类含有两个手性中心的活性分子，由于其结构的多样性，在药物中间体制备和天然产物合成等研究中发挥重要作用。大部分βhaas是关键的药物中间体，如(2s,3r)-4-甲磺酰基苯丝氨酸是合成甲砜霉素和氟苯尼考的重要中间体，甲砜霉素与氯霉素都是临床上重要的广谱抗菌剂，在治疗由细菌感染引起疾病中效果显著。(2s,3r)-4-硝基苯丝氨酸是合成氯霉素的重要中间体，同样具有较强的抗菌作用。此外，一些βhaas一些治疗疾病的直接药物，如(2s,3r)-二羟基苯基丝氨酸，是治疗帕金森的药物。其它βhaas如β-内酰胺化学合成的手性辅助物，(2s,3r)-4-氟苯丝氨酸和苯丝氨酸等在医药以及多肽开发中都具有重要作用。

2、早期βhaas的合成主要集中在化学法合成，如夏普不对称二羟基化、环氧化等方法。比如氯霉素的化学合成法主要是对硝基苯乙酮化学法，该化学法由乙苯为原始材料。经硝化-氧化-溴化-成盐-水解-乙酰化-加成-还原-分解-分拆-二氯乙酰化而得氯霉素。随着“绿色化学”，“环境友好型发展”等概念的提出，化学法由于其合成步骤繁杂，副产物多，立体选择性差以及对环境不友好等缺点限制了其进一步的发展。相比于化学法合成，生物催化作为绿色催化剂，近几年在有价值的生物有机分子合成中引起了广泛的关注。生物催化具有天然的优势，比如反应条件温和，对环境友好，反应几乎无副产物生成以及立体选择性高等。

3、βhaas的生物酶法合成主要是通过c-c键的形成建立两个手性中心。相关的酶有l-苏氨酸醛缩酶(ec 4.1.2.5)，转醛酶(ec 2.2.1.2)以及丝氨酸羟甲基转移酶(ec2.1.2.1)。这些酶都可以重新建立新的手性中心不对称合成βhaas。l-苏氨酸醛缩酶是研究最广泛的一类酶，该酶普遍催化效率较高，因此也成为了研究的热点。但是，由于l-苏氨酸醛缩酶固有的缺点，即在cβ位的选择性普遍偏低，进一步限制了其应用。尽管通过改造可以获得选择性提升的突变体，但是突变体也面临催化效率下降，稳定性降低等问题。l-苏氨酸转醛酶由于其具有天然优异的cβ位的立体选择性优势，成为现今研究的热点。已有多种来源的l-苏氨酸转醛酶得到表征，并被证明其具有优异的天然立体选择性。目前已申请的相关专利比如《一种l-苏氨酸转醛酶在氟苯尼考手性中间体合成中的应用》(申请公布号cn110540977 a)，《一种制备3-苯基-l-丝氨酸或其衍生物及其乙酯的方法》(申请公布号cn111377839 a)都已成功的将l-苏氨酸转醛酶应用到各种βhaas的合成中。但是要想实现l-苏氨酸转醛酶的工业化应用，对酶实施改造以提高催化效率是必不可少的步骤。突变体的筛选往往面临着盲目性强，筛选工作量大等劣势，因此，建立一种合适的高通量筛选方法是提高筛选效率的必经之路。相关专利如《一种l-苏氨酸转醛酶突变体的高通量快速筛选方法》(申请公布号cn 110904188a)建立了一种通过检测l-苏氨酸转醛酶反应中副产物乙醛来快速表征l-苏氨酸转醛酶突变体的方法，其筛选效率大大提高。但是该方法需要用到第二种酶，即乙醇脱氢酶或者乙醛还原酶进行耦连反应，操作过程相对较繁琐。因此，有必要开发新的更快速的高通量筛选方法，提高突变体筛选效率，获得工业上应用性更强的突变菌株。

技术实现思路

1、本发明以来自burkholderia diffusa的l-苏氨酸转醛酶bultta为目标酶，通过研究其酶的颜色变化与酶催化效率的关系，建立了一种可视化筛选bultta突变体的高通量筛选方法。为了进一步提高酶的应用潜力，通过同源建模，分子对接等手段确定影响bultta催化效率的关键氨基酸位点，结合可视化的高通量筛选方法，通过丙氨酸扫描突变(alaninescanning)、单点饱和突变(sm)以及迭代饱和突变(ism)等手段获得了催化效率与立体选择性大幅提升的突变体，同时，突变位点置换到其同源酶中，比如来自pseudomonas sp.的pslltta，来自chitiniphilus shinanonensis的chltta，来自pseudomonas sp.的psltta，所有获得的突变体都表现出优异的催化效率与立体选择性。为其工业化生产奠定了坚实的基础。

2、本发明提供了一种高通量筛选l-苏氨酸转醛酶突变体的方法，所述方法包括以下步骤：

3、(1)设计并获得含有l-苏氨酸转醛酶突变库的全细胞；

4、(2)目筛：

5、对获得的突变体的全细胞进行观察，全细胞颜色为粉色时，进行下一步筛选；

6、(3)粗酶生物催化反应：

7、对步骤(2)筛选到的全细胞进行破碎，得到粗酶液，随后通过波长扫描，测定其515nm处的吸光值，计算单位菌体量的515nm吸光值的数据，以野生型l-苏氨酸转醛酶作为对照，选取较野生型l-苏氨酸转醛酶吸光值高30％的突变体，进行粗酶生物催化反应：反应体系为0.5～1ml，其中包含对甲磺酰基苯甲醛10～30mm，l-苏氨酸20～60mm，mgcl2 1～2mm，plp 0.1mm，反应时间为10～15h，反应缓冲液50mm甲酸铵溶液(ph 7.5)；反应温度25～35℃；反应结束后，通过高速离心，获得上清液即为转化液；

8、(4)以底物的产率与de值作为检测指标，对催化反应后的转化液进行液相检测，最终获得相对于野生型催l-苏氨酸转醛酶化能力提升的突变体；

9、(5)随后对正向突变体进行基因测序，确定其突变位点。

10、在一种实施方式中，所述l-苏氨酸转醛酶的来源包括但不限于，来源于pseudomonas sp.的l-苏氨酸转醛酶pslltta，来源于chitiniphilus shinanonensis的l-苏氨酸转醛酶chltta，来源于pseudomonas sp.的l-苏氨酸转醛酶psltta。

11、在一种实施方式中，所述高通量筛选方法是通过可视化筛选结合波长扫描与高效液相检测方法筛选突变体。

12、在一种实施方式中，所述可视化筛选是通过肉眼观察重组l-苏氨酸转醛酶突变体的颜色变化，粉色的为保留活性的突变体，其他颜色如淡黄色的为降低或者丧失活性的突变体。

13、在一种实施方式中，所述波长扫描是指对保留活性的重组l-苏氨酸转醛酶的突变体的破碎上清液波长扫描，波长为515nm，通过计算l-苏氨酸转醛酶突变体单位菌体量的破碎液在515nm处的吸光值。我们将其定义为od515。

14、在一种实施方式中，所述高效液相检测方法是指检测l-苏氨酸转醛酶突变体全细胞催化的产物(2s,3r)-4-甲磺酰基苯丝氨酸的含量与非对映体选择性(de)。其结构通式为：

15、

16、所述r基团包括但不限于：氢基、烷基、烷氧基、烷基磺酰基、烷基亚磺酰基、烷基硫基、磺酸基、亚磺酸基、巯基、硝基和卤素；r基位置为邻、间或对位。

17、本发明提供了l-苏氨酸转醛酶突变体，所述突变体为，将l-苏氨酸转醛酶的第57位、59位、60位、61位、62位、63位、66位、69位、70位、71位中的至少一个进行突变后得到的；所述l-苏氨酸转醛酶为氨基酸序列如seq id no.1所示的l-苏氨酸转醛酶，或与氨基酸序列如seq id no.1所示的序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列同一性的l-苏氨酸转醛酶。

18、在一种实施方式中，所述l-苏氨酸转醛酶突变体包含位点57、59、60、61、62、63、66、69、70、71位置的一个或者多个氨基酸取代。其中57位氨基酸替代为a，q，更优选的替代为q；70位氨基酸替代为a，h，t，n，更优选的替代为t；71位点替代为a，v，t，更优选的替代为v；59、60、61、62、63、66位点替代为a。

19、在一种实施方式中，所述l-苏氨酸转醛酶突变体的催化效率是以l-苏氨酸和对甲磺酰基苯甲醛为底物进行全细胞反应，经hplc检测其产物峰面积衡量的。

20、本发明提供了一种l-苏氨酸转醛酶突变体，所述l-苏氨酸转醛酶突变体为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的l-苏氨酸转醛酶进行突变后得到的突变体：v57a，v57 q，f59a，p60a，f61a，d62a，v63a，g66a，f70a，f70h，f70t，f70n，p71a，p71v，p71t，f59a/h69a，f59a/f70a，f59a/p71a，h69a/f70a，h69a/p71a，f70a/p71a或p71t/v57q/h69t。

21、在一种实施方式中，将氨基酸序列如seq id no.1所示的l-苏氨酸转醛酶的第57位的缬氨酸突变为丙氨酸得到的，命名为v57a；

22、或所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的l-苏氨酸转醛酶的第57位的缬氨酸突变为谷氨酰胺得到的，命名为v57 q；

23、或所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的l-苏氨酸转醛酶的第59位的苯丙氨酸突变为丙氨酸得到的，命名为f59a；

24、或所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的l-苏氨酸转醛酶的第60位的脯氨酸突变为丙氨酸得到的，命名为p60a；

25、或所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的l-苏氨酸转醛酶的第61位的苯丙氨酸突变为丙氨酸得到的，命名为f61a；

26、或所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的l-苏氨酸转醛酶的第62位的天冬氨酸突变为丙氨酸得到的，命名为d62a；

27、或所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的l-苏氨酸转醛酶的第63位的缬氨酸突变为丙氨酸得到的，命名为v63a；

28、或所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的l-苏氨酸转醛酶的第66位的甘氨酸突变为丙氨酸得到的，命名为g66a；

29、或所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的l-苏氨酸转醛酶的第70位的苯丙氨酸突变为丙氨酸得到的，命名为f70a；

30、或所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的l-苏氨酸转醛酶的第70位的苯丙氨酸突变为组氨酸得到的，命名为f70h；

31、或所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的l-苏氨酸转醛酶的第70位的苯丙氨酸突变为苏氨酸得到的，命名为f70t；

32、或所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的l-苏氨酸转醛酶的第70位的苯丙氨酸突变为天冬酰胺得到的，命名为f70n；

33、或所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的l-苏氨酸转醛酶的第71位的脯氨酸突变为丙氨酸得到的，命名为p71a；

34、或所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的l-苏氨酸转醛酶的第71位的脯氨酸突变为苏氨酸得到的，命名为p71t；

35、或所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的l-苏氨酸转醛酶的第71位的脯氨酸突变为缬氨酸得到的，命名为p71v；

36、或所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的l-苏氨酸转醛酶的第59位的苯丙氨酸突变为丙氨酸，第69组的氨酸突变为丙氨酸得到的，命名为f59a/h69a；

37、或所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的l-苏氨酸转醛酶的第59位的苯丙氨酸突变为丙氨酸，第70位的苯丙氨酸突变为丙氨酸得到的，命名为f59a/f70a；

38、或所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的l-苏氨酸转醛酶的第59位的苯丙氨酸突变为丙氨酸，第71位的脯氨酸突变为丙氨酸得到的，命名为f59a/p71a；

39、或所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的l-苏氨酸转醛酶的第70位的苯丙氨酸突变为丙氨酸，第69位的组氨酸突变为丙氨酸，命名为f70a/h69a；

40、或所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的l-苏氨酸转醛酶的第69组的氨酸突变为丙氨酸，第71位的脯氨酸突变为丙氨酸得到的，命名为h69a/p71a；

41、或所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的l-苏氨酸转醛酶的第70位的苯丙氨酸突变为丙氨酸，第71位的脯氨酸突变为丙氨酸，命名为f70a/p71a；

42、或所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的l-苏氨酸转醛酶的第71位的脯氨酸突变为苏氨酸，第57位的缬氨酸突变为谷氨酰胺，同时将第69位的组氨酸突变为苏氨酸得到的，命名为p71t/v57q/h69t。

43、在一种实施方式中，编码来源于burkholderia diffusa的l-苏氨酸转醛酶bultta的核苷酸序列如seq id no.5所示。

44、在一种实施方式中，所述最优突变体置换到其他l-苏氨酸转醛酶中，最优突变体指p71t/v57q/h69t，其他l-苏氨酸转醛酶主要是来自pseudomonas sp.的pslltta，来自chitiniphilus shinanonensis的chltta，来自pseudomonas sp.的psltta。

45、在pslltta，chltta，以及psltta中，上述三个l-苏氨酸转醛酶的原始氨基酸序列如seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4所示。上述71位点的脯氨酸对应于以上三个l-苏氨酸转醛酶71位点的脯氨酸，57位点的缬氨酸对应于以上三个l-苏氨酸转醛酶57位点的半胱氨酸，69位点的组氨酸对应于chltta的69位点的酪氨酸，对应于pslltta与psltta的69位点的组氨酸。因此，以上三个l-苏氨酸转醛酶被置换后的突变体为ch-p71t-c57q-y69t、psl-p71t-c57q-h69t、ps-p70t-c57q-h69t。

46、在一种实施方式中，编码来源于pseudomonas sp.的pslltta的核苷酸序列如seqid no.7所示。

47、在一种实施方式中，编码来源于chitiniphilus shinanonensis的chltta的核苷酸序列如seq id no.6所示。

48、在一种实施方式中，编码来源于pseudomonas sp.的psltta的核苷酸序列如seqid no.8所示。

49、在一种实施方式中，所述l-苏氨酸转醛酶突变体为，将氨基酸序列如seq id no.2所示的l-苏氨酸转醛酶的第71位的脯氨酸突变为苏氨酸，第57位的缬氨酸突变为谷氨酰胺，同时将第69位的酪氨酸突变为苏氨酸得到的，命名为ch-p71t/c57q/y69t。

50、在一种实施方式中，所述l-苏氨酸转醛酶突变体为，将氨基酸序列如seq id no.3所示的l-苏氨酸转醛酶的第71位的脯氨酸突变为苏氨酸，第57位的缬氨酸突变为谷氨酰胺，同时将第69位的组氨酸突变为苏氨酸得到的，命名为psl-p71t/c57q/h69t。

51、在一种实施方式中，所述l-苏氨酸转醛酶突变体为，将氨基酸序列如seq id no.4所示的l-苏氨酸转醛酶的第71位的脯氨酸突变为苏氨酸，第57位的缬氨酸突变为谷氨酰胺，同时将第69位的组氨酸突变为苏氨酸得到的，命名为ps-p71t/c57q/h69t。

52、本发明还提供了编码上述突变体的基因。

53、本发明还提供了一种携带所述突变体，或携带上述基因的重组载体。

54、在本发明的一种实施方式中，所述重组载体是以pet系列载体如pet-28a质粒、pet-21a质粒、prsf系列载体如prsf-duet1质粒、pgex系列载体如pgex-6p-1质粒为表达载体。

55、在本发明的一种实施方式中，所述重组载体以pet28a质粒、prsf-duet1质粒、pet21a质粒或pgex-6p-1质粒为表达载体。

56、本发明还提供了一种表达上述突变体，携带上述基因，或携带上述重组载体的重组细胞。

57、在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞以细菌或真菌为表达宿主。

58、在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞以大肠杆菌为表达宿主。

59、本发明提供了携带l-苏氨酸转醛酶的重组载体。

60、在本发明的一种实施方式中，所述重组载体以pet28a、prsf-duet1、pet21a或pgex-6p-1为表达载体。

61、本发明还提供了一种制备β-羟基-α-氨基酸的方法，所述方法为，以l-苏氨酸为供体底物，以苯甲醛及其衍生物为受体底物，采用采用氨基酸序列如seq id no.1所示的l-苏氨酸转醛酶或上述突变体上述重组细胞或上述重组大肠杆菌全细胞转化制备得到β-羟基-α-氨基酸，所述β-羟基-α-氨基酸为苯基丝氨酸及其衍生物。

62、在本发明的一种实施方式中，所述苯甲醛及其衍生物的结构通式为：

63、

64、所述r基团包括但不限于：氢基、烷基、烷氧基、烷基磺酰基、烷基亚磺酰基、烷基硫基、磺酸基、亚磺酸基、巯基、硝基和卤素；r基位置为邻、间或对位。

65、在本发明的一种实施方式中，所述苯基丝氨酸及其衍生物的结构通式为：

66、

67、所述r基团包括但不限于：氢基、烷基、烷氧基、烷基磺酰基、烷基亚磺酰基、烷基硫基、磺酸基、亚磺酸基、巯基、硝基和卤素；r基位置为邻、间或对位。

68、在本发明的一种实施方式中，所述苯基丝氨酸衍生物的获得以l-苏氨酸为供体底物，以苯甲醛及其衍生物为受体底物，经l-苏氨酸转醛酶全细胞生物催化获得。所述反应通式如式1所示：

69、

70、在本发明的一种实施方式中，所述r基团包括但不限于：氢基、烷基、烷氧基、烷基磺酰基、烷基亚磺酰基、烷基硫基、磺酸基、亚磺酸基、巯基、硝基和卤素；r基位置为邻、间或对位。

71、在本发明的一种实施方式中，所述l-苏氨酸转醛酶的全细胞催化体系包含但不限于l-苏氨酸100mm，苯甲醛及其衍生物50mm，氯化镁(mgcl2)1mm，磷酸吡哆醛(plp)0.1mm，10％的二甲基亚砜(dmso)作为助溶剂。反应缓冲液为50mm的甲酸铵溶液(ph 7.5)，反应时间为10h，反应温度为25～40℃，比如30℃。

72、本发明还提供了上述氨基酸序列如seq id no.1所示的l-苏氨酸转醛酶或上述突变体在转化催化l-苏氨酸与苯甲醛及其衍生物发生羟醛缩合反应生成β-羟基-α-氨基酸的应用。

73、本发明还提供了一种提高l-苏氨酸转醛酶转化苯甲醛或其衍生物制备β-羟基-α-氨基酸的产率的方法，所述方法为，将l-苏氨酸转醛酶的第57位、59位、60位、61位、62位、63位、66位、69位、70位、71位中的至少一个进行突变。

74、在本发明的一种实施方式中，所述方法为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的l-苏氨酸转醛酶进行突变，并得到如下突变体：v57a，v57 q，f59a，p60a，f61a，d62a，v63a，g66a，f70a，f70h，f70t，f70n，p71a，p71v，p71t，f59a/h69a，f59a/f70a，f59a/p71a，h69a/f70a，h69a/p71a，f70a/p71a或p71t/v57q/h69t。

75、在本发明的一种实施方式中，分别将氨基酸序列如seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4任一所示的l-苏氨酸转醛酶进行突变，并依次分别得到的突变体：ch-p71t/c57q/y69t、psl-p71t/c57q/h69t、ps-p71t/c57q/h69t。

76、本发明还提供了上述l-苏氨酸转醛酶突变体，或上述基因，或上述重组载体，或上述重组细胞在制备苯基丝氨酸及其衍生物或含有苯基丝氨酸及其衍生物的产品中的应用。

77、在本发明的一种实施方式中，所述苯甲醛及其衍生物的结构通式为：

78、

79、在本发明的一种实施方式中，所述r基团包括但不限于：氢基、烷基、烷氧基、烷基磺酰基、烷基亚磺酰基、烷基硫基、磺酸基、亚磺酸基、巯基、硝基和卤素；r基位置为邻、间或对位。

80、在本发明的一种实施方式中，所述苯基丝氨酸及其衍生物的结构通式为：

81、所述r基团包括但不限于：氢基、烷基、烷氧基、烷基磺酰基、烷基亚磺酰基、烷基硫基、磺酸基、亚磺酸基、巯基、硝基和卤素；r基位置为邻、间或对位。

82、在本发明的一种实施方式中，所述产品为化学品。

83、有益效果

84、(1)本发明基于l-苏氨酸转醛酶特有的颜色特征，证明了其酶的颜色与产率和非对映体选择性的关系，并基于此建立了突变体的可视化高通量筛选方法，该方法可以通过肉眼观察表达该酶的细胞的颜色来评估突变体的催化能力，在大批量的筛选工作用大大降低了筛选突变体的工作量，极大幅度地提高了突变酶的筛选效率。

85、(2)本发明基于l-苏氨酸转醛酶的结构特征，确定了影响其催化效率的关键位点，采用丙氨酸扫描突变、位点饱和突变以及迭代饱和突变技术，结合可视化高通量筛选方法，成功获得催化效率与立体选择性大幅提升的突变体。该高通量筛选方法可以大大提高筛选效率，较之前专利中发明的高通量筛选方法相比，该方法无需耦连第二种酶，且通过肉眼观察便可筛选大量的突变体，大大节省了时间与成本。获得的突变体的催化能力与非对映体选择性大幅提高，特别是非对映体选择性接近100％，大大降低了后期产物分离纯化的成本，并将其突变体应用至各种βhaas的全细胞生物合成中。全细胞生物催化反应不需要繁琐的步骤，无多余的副产物生成，反应条件温和，对环境友好。本发明通过生物催化一步法获得目标产物，是一种绿色高效的生物合成βhaas的方法。