一种基因修饰的CAR-NK细胞及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种基因修饰的car-nk细胞及其制备方法和应用，属于遗传工程。

背景技术：

1、近年来，以特异性抗肿瘤免疫疗法为首的细胞生物治疗己经初露锋芒，成为肿瘤生物治疗中重要的发展方向。自然杀伤细胞(natural killer cell，nk细胞)，是除t细胞、b细胞之外的第三大类淋巴细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调解有关，甚至参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。nk细胞无需抗原致敏就可直接杀伤肿瘤和病毒感染的靶细胞，而且无mhc限制性，应答速度快，在机体抗肿瘤和抗感染免疫早期即可发挥作用。

2、nk细胞的主要缺点是其在缺乏细胞因子支持的情况下，过继转移后缺乏持久性。肿瘤微环境的存在，也使得利用nk细胞治疗实体肿瘤仍然是一个挑战，它会损害nk细胞的功能，抑制其发挥免疫作用。因此，工程改造nk细胞以表达细胞因子来增强其持久性对它们的临床活性很重要。

3、cn113518821a将il-15、il-15r、il-12、il-12r中的至少一种外源核酸表达在淋巴细胞中，并使tgfβr2、cish、tigit、adora2a、或nkg2a其中至少一种功能丧失，但其实验结果中只给出了部分实验方案的数据，无法判断其余实验方案的效果。cn112292390a专利中提供了表达il-15和敲除cish的nk细胞，其主要给出的是car-cd19的数据，且敲除的是cish基因。cn113518826a专利中提供了敲除tgfβr2的nk细胞，不涉及双基因敲除。

4、lewis y抗原属于a、b、h、lewis血型家族，为ii型h物质，在人的多种上皮组织癌细胞中，如肺癌、结肠癌、卵巢癌和前列腺癌，都有lewis y抗原的非正常高表达。而健康人的lewis y抗原仅在含有上皮细胞的少数组织中以相对较低的水平表达。因此，lewisy抗原被认为是肿瘤相关抗原，是基于car-t治疗的一个有希望的靶点。

5、现有技术中有针对nk细胞进行双敲除免疫抑制因子和表达细胞因子，并进行car修饰，制备car-nk细胞的报告，但是在上述基础上，再结合lewis y单链抗体的，并未有报道。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明提供一种基因修饰的car-nk细胞及其制备方法和应用，实现以下发明目的：针对nk细胞进行双敲除tigit和adora2a免疫抑制因子，同时表达il-18细胞因子，并结合lewis y单链抗体，进行car修饰，制备的car-nk细胞，对肿瘤细胞的杀伤率高；在于靶细胞共培养时，可以释放更多的tnf-α、ifn–r。

2、与现有技术相比，本发明采取以下技术方案：

3、一种基因修饰的car-nk细胞，采用含car-lewis-y的重组表达载体感染通用型nk细胞得到car-nk细胞；所述通用型nk细胞为敲除tigit基因和敲除adora2a基因，并表达il-18的nk细胞。

4、所述car-lewis-y的核苷酸序列如序列表中seq id no.6所示。

5、所述car-lewis-y由以下模块组成：leader、lewis-y单链抗体、cd8 hinge区、cd8跨膜区、cd28共刺激区、4-1bb共刺激区、cd3ζ信号传导区。

6、所述敲除tigit基因采用的sgrna的核苷酸序列如序列表中seq id no.1所示；所述敲除adora2a基因采用的sgrna的核苷酸序列如序列表中seq id no.3所示；所述il-18的核苷酸序列为序列表中seq id no.5所示。

7、所述制备方法包括制备敲除tigit和adora2a基因的nk细胞、制备表达il-18的双敲除nk细胞、含car-lewis-y的重组表达载体感染通用型nk细胞。

8、所述制备敲除tigit和adora2a基因的nk细胞的方法为：将敲除adora2a基因采用的sgrna和敲除adora2a基因采用的sgrna，同时连接到px458载体中，获得含有双靶点tigitsgrna1和adora2a sgrna1的重组载体px458-ti-ad-1，将该重组载体电转染到nk细胞中，得到敲除tigit和adora2a基因的nk细胞。

9、所述制备表达il-18的双敲除nk细胞的方法为：将il-18连接到plent-ef1α载体上，得到plent-ef1α-il-18，对其进行慢病毒包装后，感染敲除tigit和adora2a基因的nk细胞，得到表达il-18的双敲除nk细胞，即通用型nk细胞。

10、所述含car-lewis-y的重组表达载体感染通用型nk细胞的方法为：将含car-lewis-y的重组表达载体进行慢病毒包装后，感染通用型nk细胞，得到car-nk细胞。

11、所述的car-nk细胞在制备治疗抗肿瘤药物中的应用。

12、与现有技术相比，本发明取得以下有益效果：

13、（1）本发明制备的car-lewis-y-nk细胞，与靶细胞hcc-827混合培养72h后，细胞因子tnf-α的分泌量为2745 pg/ml，细胞因子ifn-γ的分泌量为3067 pg/ml，与靶细胞lovo混合培养72h后，细胞因子tnf-α的分泌量为2967pg/ml，细胞因子ifn-γ的分泌量为3557pg/ml。

14、（2）本发明制备的car-lewis-y-nk细胞对hcc-827细胞的杀伤率为91.3%，对lovo细胞的杀伤率为92.1%。

15、（3）本发明制备的car-lewis-y-nk细胞，可以明显减小肿瘤的体积。

技术特征：

1.一种基因修饰的car-nk细胞，其特征在于：采用含car-lewis-y的重组表达载体感染通用型nk细胞得到car-nk细胞；所述通用型nk细胞为敲除tigit基因和敲除adora2a基因，并表达il-18的nk细胞。

2. 根据权利要求1所述的一种基因修饰的car-nk细胞，其特征在于：所述car-lewis-y的核苷酸序列如序列表中seq id no.6所示。

3. 根据权利要求1所述的一种基因修饰的car-nk细胞，其特征在于：所述car-lewis-y由以下模块组成：leader、lewis-y单链抗体、cd8 hinge区、cd8跨膜区、cd28共刺激区、4-1bb共刺激区、cd3ζ信号传导区。

4. 根据权利要求1所述的一种基因修饰的car-nk细胞，其特征在于：所述敲除tigit基因采用的sgrna的核苷酸序列如序列表中seq id no.1所示；所述敲除adora2a基因采用的sgrna的核苷酸序列如序列表中seq id no.3所示；所述il-18的核苷酸序列为序列表中seqid no.5所示。

5.权利要求1所述car-nk细胞的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括制备敲除tigit和adora2a基因的nk细胞、制备表达il-18的双敲除nk细胞、含car-lewis-y的重组表达载体感染通用型nk细胞。

6. 权利要求5所述car-nk细胞的制备方法，其特征在于：所述制备敲除tigit和adora2a基因的nk细胞的方法为：将敲除adora2a基因采用的sgrna和敲除adora2a基因采用的sgrna，同时连接到px458载体中，获得含有双靶点tigit sgrna1和adora2a sgrna1的重组载体px458-ti-ad-1，将该重组载体电转染到nk细胞中，得到敲除tigit和adora2a基因的nk细胞。

7.权利要求6所述car-nk细胞的制备方法，其特征在于：所述制备表达il-18的双敲除nk细胞的方法为：将il-18连接到plent-ef1α载体上，得到plent-ef1α-il-18，对其进行慢病毒包装后，感染敲除tigit和adora2a基因的nk细胞，得到表达il-18的双敲除nk细胞，即通用型nk细胞。

8.权利要求7所述car-nk细胞的制备方法，其特征在于：所述含car-lewis-y的重组表达载体感染通用型nk细胞的方法为：将含car-lewis-y的重组表达载体进行慢病毒包装后，感染通用型nk细胞，得到car-nk细胞。

9.权利要求1所述的car-nk细胞在制备治疗抗肿瘤药物中的应用。

技术总结
本发明提供一种基因修饰的CAR‑NK细胞及其制备方法和应用，属于遗传工程技术领域；采用含CAR‑Lewis‑Y的重组表达载体感染通用型NK细胞得到CAR‑NK细胞；所述通用型NK细胞为敲除TIGIT基因和敲除ADORA2A基因，并表达IL‑18的NK细胞；本发明还提供上述CAR‑NK细胞的制备方法及其应用。本发明制备的CAR‑Lewis‑Y‑NK细胞，与靶细胞HCC‑827混合培养72h后，细胞因子TNF‑α和IFN‑γ的分泌量明显增加。本发明制备的CAR‑Lewis‑Y‑NK细胞对HCC‑827细胞的杀伤率为91.3%，对LOVO细胞的杀伤率为92.1%。

技术研发人员：刘明录,郭爱萍,强邦明,张传鹏,王海燕,金海锋,王立新,冯建海
受保护的技术使用者：山东兴瑞生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13