一种抗HIV-I单克隆抗体及其制备方法、试剂盒和应用与流程

本发明属于免疫学领域和分子病毒学的，尤其涉及一种抗hiv-i单克隆抗体及其制备方法、试剂盒和应用。

背景技术：

1、hiv(humanimmunodeficiency virus)俗称艾滋病毒，是逆转录病毒的一类，全长约9.18kb的碱基对，可引起人类获得性免疫缺损综合症(aids)。目前，根据血清学反应和病毒核酸序列测定可分为hiv-i和hiv-ii两型；其中，hiv-i的致病力强，是引起全球艾滋病流行的主要病原。

2、目前，对hiv进行检测的方法主要有免疫学方法、分子生物学方法以及基因芯片技术。其中，免疫学方法指的是检测样品中检测对象的抗体或抗原的存在及存在量，是艾滋病病毒检测的基本检测方法，具有无法替代的地位。

3、在免疫学方法中，对hiv进行处理制备得到抗原，使用该抗原免疫小鼠，并通过融合实验以及杂交瘤细胞的筛选得到能稳定分泌某种单克隆抗体的杂交瘤细胞，通过对细胞培养物的处理和纯化，最终得的抗体可作为hiv的检测试剂。因此，抗原的质量是影响hiv免疫学方法的检测准确性最关键因素，故本领域中存在的对抗原的性能不断改进以更好地提升、满足hiv体外检测能力的需求。但是，由于hiv病毒的抗原较大，在体外难以实现完整抗原蛋白的表达，或者即使实现体外表达，分子量比较大的抗原蛋白也往往不能正确折叠，导致后期的复性困难，或者复性获得的抗原活性很差，由此制备得到的抗体与天然hiv病毒蛋白的结合力弱、特异性差，限制了hiv免疫学方法的发展。

技术实现思路

1、为了得到一种与天然hiv-i病毒蛋白具有良好的特异性结合能力的抗体，本发明提供了一种抗hiv-i单克隆抗体及其制备方法、试剂盒和应用。

2、第一方面，本发明提供的单克隆抗体或其抗原结合片段采用以下的技术方案：

3、一种单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段的重链可变区包括与seq id no:1具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，轻链可变区包括与seqid no:2具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些具体的实施方式中，所述重链可变区包括氨基酸序列如seq id no:3～5所示的互补决定区1～3，所述轻链可变区包括氨基酸序列如seq id no:6～8所述的互补决定区1～3。

4、在一些具体的实施方式中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段由单克隆细胞株分泌表达，所述单克隆细胞株中包括核苷酸序列如seq id no:9和/或seq id no:10所示的核酸分子。

5、在一些具体的实施方式中，所述单克隆抗体选自lgg、lga、lgm、lge和lgd中的一种或多种。

6、在一些具体的实施方式中，所述抗原结合片段选自fab片段、fab’片段、f(ab’)2片段、fd片段、fd’片段、fv片段、scfv片段、ds-scfv片段、dab片段、单链片段、二价抗体和线性抗体中的一种或多种。

7、第二方面，本发明提供的制备上述单克隆抗体或其抗原结合片段的方法采用以下的技术方案：

8、一种制备单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括以下步骤：

9、s1、重组hiv-i p15蛋白的制备：将核苷酸序列如seq id no:11所示的核酸片段整合至表达载体上，构建得到重组hiv-i p15表达质粒，将所述重组hiv-i p15表达质粒转化至载体细胞内，收集、纯化细胞培养物，得到所述重组hiv-i p15蛋白；

10、s2、杂交瘤细胞株的制备：采用所述重组hiv-i p15蛋白作为抗原，进行动物免疫、细胞免疫、融合实验以及杂交瘤细胞筛选，得到稳定分泌所述单克隆抗体或其抗原结合片段的杂交瘤细胞株；

11、s3、单克隆抗体或其抗原结合片段的制备：将所述杂交瘤细胞株注射至免疫动物体内制备腹水，纯化、分离所述腹水得到单克隆抗体或其抗原结合片段。

12、在一些具体的实施方式中，所述表达载体选自pet-30a表达载体、pcmv-163表达载体、pbi-cmv4表达载体、psv2-dhfr表达载体中的一种或多种。

13、在一些具体的实施方式中，所述载体细胞选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和链霉菌中的一种或多种。

14、第三方面，本发明提供的试剂盒采用以下的技术方案：

15、一种试剂盒，包括上述单克隆抗体或其抗原结合片段。

16、在一些具体的实施方式中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段标记有检测物质，所述检测物质选自放射性同位素、荧光染料、生物素、胶体金和酶中的一种或多种。

17、第四方面，本发明提供上述单克隆抗体或其抗原结合片段和/或试剂盒在非诊断目的hiv检测和/或hiv科学研究实验中的应用。

18、有益效果：

19、本发明选择hiv-i上具有良好免疫原性的p15蛋白上的优势表位，并采用基因工程技术得到重组hiv-i p15蛋白，以该重组hiv-i p15蛋白作为抗原进行动物免疫、细胞免疫、融合实验、杂交瘤细胞筛选、腹水制备、纯化盒分离，得到与hiv-i具有优秀的特异性结合能力的单克隆抗体或其抗原结合片段，其既可应用于hiv-i检测中，也可应用于hiv-i在细胞、器官等不同水平的分布以及作用机制的研究中，具有良好的应用前景。

技术特征：

1.一种单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述单克隆抗体或其抗原结合片段的重链可变区包括与seq id no:1具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，轻链可变区包括与seq id no:2具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区包括氨基酸序列如seq id no:3～5所示的互补决定区1～3，所述轻链可变区包括氨基酸序列如seq id no:6～8所述的互补决定区1～3。

3.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述单克隆抗体或其抗原结合片段由单克隆细胞株分泌表达，所述单克隆细胞株中包括核苷酸序列如seqid no:9和/或seq id no:10所示的核酸分子。

4.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述单克隆抗体选自lgg、lga、lgm、lge和lgd中的一种或多种。

5.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗原结合片段选自fab片段、fab’片段、f(ab’)2片段、fd片段、fd’片段、fv片段、scfv片段、ds-scfv片段、dab片段、单链片段、二价抗体和线性抗体中的一种或多种。

6.一种制备权利要求1～5任一所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的制备单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，其特征在于，所述表达载体选自pet-30a表达载体、pcmv-163表达载体、pbi-cmv4表达载体、psv2-dhfr表达载体中的一种或多种；

8.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～5任一所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述单克隆抗体或其抗原结合片段修饰有标记物，所述标记物选自放射性同位素、荧光染料、生物素、胶体金和酶中的一种或多种。

10.权利要求1～5任一所述的单克隆抗体或其抗原结合片段和/或权利要求8或9所述的试剂盒在非诊断目的hiv检测和/或hiv科学研究实验中的应用。

技术总结
本发明属于免疫学领域和分子病毒学的技术领域，公开了一种抗HIV‑I单克隆抗体及其制备方法、试剂盒和应用。一种单克隆抗体或其抗原结合片段，其重链可变区包括与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性同源性的氨基酸序列，轻链可变区包括与SEQ ID NO:2具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。本发明提供的单克隆抗体与天然HIV‑I病毒蛋白具有优秀的特异性结合能力，其既可应用于HIV‑I检测中，也可应用于HIV‑I在细胞、器官等不同水平的分布以及作用机制的研究中，具有良好的应用前景。

技术研发人员：刘杰,黄杰良
受保护的技术使用者：厦门万渤生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14