一株耐硫酸铵酿酒酵母及其筛选方法

本发明涉及生物，具体为一株耐硫酸铵酿酒酵母及其筛选方法。

背景技术：

1、酿酒酵母具有很多优点，如生长周期短，发酵能力强、容易进行大规模培养，含有多种蛋白质、氨基酸、维生素、生物活性物质等丰富的营养成分等，在食品、医药等领域被广泛应用。同时，酿酒酵母也常被当做蛋白饲料的主要发酵菌株，在蛋白饲料中添加酿酒酵母，可以有效地提高饲料的营养价值，改善动物的生长发育状况；还可以改善饲料的风味和适口性，增加饲料的香味，从而提高动物对饲料的食欲和摄食量。此外，酿酒酵母中还含有丰富的有机酸和抗生素，可以替代一部分抗生素的使用，从而降低了养殖成本。在发酵过程中酿酒酵母的蛋白含量和耐受性一直是目前研究的热点。在蛋白饲料的生产中，硫酸铵为菌株的生长提供氮源，但高浓度的硫酸铵会抑制酵母菌的生长。利用耐盐酿酒酵母发酵蛋白饲料，可以增强其抗逆能力，使其在高渗透压的环境下仍能正常生长和发酵，从而提高产品的稳定性和质量。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一株耐硫酸铵酿酒酵母及其筛选方法，该耐硫酸铵酿酒酵母可以在较高浓度的硫酸铵环境下生长繁殖，是用于蛋白饲料固态发酵的优良菌株。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

3、一株耐硫酸铵酿酒酵母，命名为酿酒酵母（ saccharomyces cerevisiae）z-1，并于2023年03月03日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no：63227，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

4、进一步地，所述酿酒酵母（ saccharomyces cerevisiae）z-1能在1.0 mol/l nh4+浓度环境下生长繁殖。

5、本发明还提供一种耐硫酸铵酿酒酵母的筛选方法，包括以下步骤：

6、s1：从葡萄自然发酵液中分离出多株酿酒酵母，并得到种子液，对多株酿酒酵母的种子液进行编号；

7、s2：初步筛选耐盐酿酒酵母：将s1中编号的酿酒酵母种子液分别接种于不同nh4+浓度的硫酸铵琼脂培养基上进行培养，筛选出菌落大且饱满的3-5株酿酒酵母：

8、s3：测定生长曲线：将s1中编号的酿酒酵母种子液分别接种于ypd液体培养基中进行培养，绘制生长曲线并确定生长稳定期，筛选出生长稳定期内生长情况优良的3-5株酿酒酵母；

9、s4：测定蛋白含量：将s1中编号的酿酒酵母种子液接种于ypd液体培养基中进行培养得菌悬液，培养后测量菌悬液中蛋白含量，筛选出蛋白含量较多的3-5株酿酒酵母；

10、s5：综合分析比较s2、s3、s4中筛选出的酿酒酵母，从而筛选出高耐盐、生长情况优良的高蛋白酿酒酵母菌株。

11、进一步地，所述步骤s1中从葡萄自然发酵液中分离出15株酿酒酵母，并分别编号为：z-1、z-2、z-3、z-4、z-5、z-6、1-1、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9。

12、进一步地，所述步骤s2中测定生长曲线的具体操作步骤为：将分离得到的15株酿酒酵母种子液分别取4 μl整齐的点在含有0 mol/l、0.2 mol/l、0.4 mol/l、0.6 mol/l、0.8mol/l、1.0 mol/l、1.2 mol/l nh4+的硫酸铵琼脂培养基上，30℃恒温培养箱倒置培养48 h；每个水平做3个重复，经48h培养后筛选菌落大且饱满的酿酒酵母。

13、进一步地，所述步骤s3中测定生长曲线的具体方法为：将步骤s1分离得到的15株酿酒酵母种子液分别以1％的接种量分别接种到300 ml ypd液体培养基中，同时做一组未接种酿酒酵母种子液的空白对照，于30℃、180 rpm条件下振荡培养，并于接种后0 h、2 h、4h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、20 h、22 h、24 h分别取样3ml，以空白对照调零，测定酿酒酵母在600 nm处的吸光值，然后以酿酒酵母吸光值作为纵坐标，生长时间作为横坐标，绘制生长曲线，筛选出生长稳定期内生长情况优良的3-5株酿酒酵母。

14、进一步地，所述步骤s4中测定蛋白含量的具体方法为：将步骤s1分离得到的15株酿酒酵母种子液以1％的接种量分别接种至300 ml ypd液体培养基，于30℃、180 rpm的条件下振荡培养48 h，得菌悬液；对每一瓶菌悬液中的蛋白质含量进行测定；筛选出蛋白含量较多的3-5株酿酒酵母。

15、进一步地，所述步骤s2、s3、s4中酿酒酵母种子液的od600均一致。

16、进一步地，步骤s4中对每一瓶菌悬液中的蛋白质含量进行测定时，每一组重复三次，且具体操作方法为：

17、将发酵培养48 h后的菌悬液，4500 rpm离心10 min，弃上清，用蒸馏水洗涤，洗涤重复3次后，放入 105℃烘箱内烘至恒重或冷冻干燥至恒重，冷却后利用 gb/t 5009.5-2003 规定测定蛋白含量方法对酵母菌体测定粗蛋白含量，如下：

18、

19、式中：v2—滴定样品消耗的标准盐酸溶液体积ml；

20、v1—空白对照所需的标准盐酸溶液体积ml；

21、c—标准盐酸溶液的浓度；

22、m—试样的质量g；

23、v—试样消解液总体积ml；

24、v＇—蒸馏用消解液体积ml；

25、0.0140—每毫克当量氮的克数；

26、6.25—氮换算成蛋白质的平均系数。

27、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

28、本发明提供的耐硫酸铵酿酒酵母z-1可在1.0 mol/l nh4+（6.6%硫酸铵（w/v））的环境下生长繁殖，不仅可以适应固态发酵的高渗环境，同时还可利用相对廉价的硫酸铵无机盐转化为蛋白质。相对于现有菌株，本发明菌株蛋白含量能够达到51.97%，以其作为蛋白饲料发酵菌株，不仅可以适应高耐受环境，还可以增加蛋白饲料的蛋白含量，是用于固态发酵的优良菌株。

技术特征：

1. 一株耐硫酸铵酿酒酵母，其特征在于，命名为酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）z-1，并于2023年03月03日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no：63227，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

2. 根据权利要求1所述的耐硫酸铵酿酒酵母，其特征在于，所述酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）z-1能在1.0 mol/l nh4+浓度环境下生长繁殖。

3.一种耐硫酸铵酿酒酵母的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的一种耐硫酸铵酿酒酵母的筛选方法，其特征在于，所述步骤s1中从葡萄自然发酵液中分离出15株酿酒酵母，并分别编号为：z-1、z-2、z-3、z-4、z-5、z-6、1-1、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9。

5. 根据权利要求4所述的一种耐硫酸铵酿酒酵母的筛选方法，其特征在于，所述步骤s2中测定生长曲线的具体操作步骤为：将分离得到的15株酿酒酵母种子液分别取4 μl整齐的点在含有0 mol/l、0.2 mol/l、0.4 mol/l、0.6 mol/l、0.8 mol/l、1.0 mol/l、1.2 mol/lnh4+的硫酸铵琼脂培养基上，30℃恒温培养箱倒置培养48 h；每个水平做3个重复，经48h培养后筛选菌落大且饱满的酿酒酵母。

6. 根据权利要求4所述的一种耐硫酸铵酿酒酵母的筛选方法，其特征在于，所述步骤s3中测定生长曲线的具体方法为：将步骤s1分离得到的15株酿酒酵母种子液分别以1％的接种量分别接种到300 ml ypd液体培养基中，同时做一组未接种酿酒酵母种子液的空白对照，于30℃、180 rpm条件下振荡培养，并于接种后0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、20 h、22 h、24 h分别取样3ml，以空白对照调零，测定酿酒酵母在600 nm处的吸光值，然后以酿酒酵母吸光值作为纵坐标，生长时间作为横坐标，绘制生长曲线，筛选出生长稳定期内生长情况优良的3-5株酿酒酵母。

7. 根据权利要求4所述的一种耐硫酸铵酿酒酵母的筛选方法，其特征在于，所述步骤s4中测定蛋白含量的具体方法为：将步骤s1分离得到的15株酿酒酵母种子液以1％的接种量分别接种至300 ml ypd液体培养基，于30℃、180 rpm的条件下振荡培养48 h，得菌悬液；对每一瓶菌悬液中的蛋白质含量进行测定；筛选出蛋白含量较多的3-5株酿酒酵母。

8.根据权利要求3所述的一种耐硫酸铵酿酒酵母的筛选方法，其特征在于，所述步骤s2、s3、s4中酿酒酵母种子液的od600均一致。

9.根据权利要求6所述的一种耐硫酸铵酿酒酵母的筛选方法，其特征在于，步骤s4中对每一瓶菌悬液中的蛋白质含量进行测定时，每一组重复三次，且具体操作方法为：

技术总结
本发明公开了一株耐硫酸铵酿酒酵母及其筛选方法，涉及生物技术领域，命名为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Z‑1，并于2023年03月03日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：63227，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。本发明提供的耐硫酸铵酿酒酵母Z‑1可在1.0 mol/L NH<subgt;4</subgt;<supgt;+</supgt;（6.6%硫酸铵）的环境下生长繁殖，且蛋白含量能够达到51.97%，以其作为蛋白饲料发酵菌株，不仅可以适应高耐受环境，还可以增加蛋白饲料的蛋白含量，是用于固态发酵的优良菌株。

技术研发人员：刘占英,张乐,苏晓明
受保护的技术使用者：内蒙古工业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13