一种抗PD-1和PCSK9的双特异性抗体及应用

本发明涉及生物医药领域，尤其是涉及一种抗pd-1和pcsk9的双特异性抗体及应用。

背景技术：

1、pd-1即“程序性死亡受体-1”，可与其内源性配体pd-l1(b7-h1)或pd-l2(b7-dc)结合，pd-l1是pd-1的主要配体，但pd-l2与pd-1的亲和性更强，可竞争pd-l1与pd-1的结合位点。pd-1的主要功能是作为一种重要的免疫抑制分子，可从多个层面阻止t细胞的激活，在免疫耐受中发挥着重要的作用。pd-1免疫检查点抑制剂在肿瘤治疗领域备受瞩目。虽然免疫检查点抑制治疗取得了很大的成功，但是只在部分数量的患者中表现出持续的临床治疗响应，而且会出现耐药性。pd-1治疗耐药可以分为：原发性耐药，继发(或获得性)耐药。针对pd-1治疗耐药性的问题，目前主要使用的方法有加强t细胞启动、逆转t细胞耗竭、增加t细胞浸润、改善免疫抑制微环境以及联合治疗等手段。

2、pcsk9由肝脏产生，与肝细胞表面的ldlr相互作用并降解，是调节胆固醇代谢的关键蛋白，已被确定为高胆固醇血症的治疗靶点。针对pcsk9的抗体可以阻断pcsk9与ldlr的结合，降低血浆ldl水平，从而起到降脂作用，在外源胆固醇的代谢中发挥着重要的调节作用，目前已有多款pcsk9抗体药物上市。近些年研究发现，pcsk9在改善肿瘤微环境，增强cd8+t淋巴细胞的肿瘤浸润，对改善/逆转pd-1治疗耐药有积极作用。杜克大学chuan-yuan li教授课题组的研究人员发现pcsk9在调节细胞表面mhc-i水平中具有重要作用，抑制pcsk9可促进t细胞向肿瘤内浸润，从而增强肿瘤免疫检查点抑制剂的治疗效果。在小鼠肿瘤模型中，pcsk9的敲除可与pd-1抗体协同抑制致肿瘤生长。

技术实现思路

1、本发明的目的就是针对现有技术中pd-1抗体药物存在的缺陷而提供一种抗pd-1和pcsk9的双特异性抗体及应用。

2、本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

3、本发明的技术方案之一为提供一种抗pd-1和pcsk9的双特异性抗体，包括：

4、a、特异性识别和结合pd-1的结构域，其包括抗pd-1特异性抗体的重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.2所示；

5、b、特异性识别和结合psck9的结构域，其包括抗psck9特异性抗体的重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no.3所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.4所示。

6、进一步地，所述抗pd-1和pcsk9的双特异性抗体为y-body形式、scfv-igg形式、igg-scfv形式、或dvd-igg形式，其中，

7、y-body形式的双特异性抗体由两条不同的重链和一条轻链组成，其中，一条重链为vh(anti-pd-1)-linker-vl(anit-pd-1)-linker-ch时，另一条重链为vh(anti-pcsk9)-ch；轻链为vl(anti-pcsk9)-cl；

8、scfv-igg形式的双特异性抗体由两条相同的重链和两条相同的轻链组成，其中重链为vh(anti-pd-1)-linker-vl(anti-pd-1)-linker-vh(anti-pcsk9)-ch，轻链为vl(anti-pcsk9)-cl；

9、igg-scfv形式的双特异性抗体由两条相同的重链和两条相同的轻链组成，其中重链为vh(anti-pcsk9)-ch-linker-vh(anti-pd-1)-linker-vl(anti-pd-1)，轻链为vl(anti-pcsk9)-cl；

10、dvd-igg形式的双特异性抗体由两条相同的重链和两条相同的轻链组成，其中重链为vh(anti-pd-1)-linker-vh(anti-pcsk9)-ch，轻链为vl(anti-pd-1)-linker-vl(anti-pcsk9)-cl。

11、更进一步地，所述ch(ch重链恒定区)选自igg4fc(hole)(aa)的ch2以及ch3区域、igg4fc(knob)(aa)、igg1 fc、igg4 fc中的任意一个，其中igg4fc(hole)(aa)的ch2以及ch3区域的氨基酸序列如seq id no.5所示，igg4 fc(knob)(aa)的氨基酸序列如seq id no.6，igg1 fc的氨基酸序列如seq id no.7，igg4 fc的氨基酸序列如seq id no.8所示；

12、所述cl选自κ或λ轻链中的任意一个；

13、所述linker选自氨基酸序列如seq id no.19所示的linker1、如seq id no.20所示的linker2、如seq id no.21所示的linker3、如seq id no.22所示的linker4、如seq idno.23所示的linker5、如seq id no.24所示的linker6中的任意一个。

14、更进一步地优选，所述y-body形式的双特异性抗体中，

15、vh(anti-pd-1)-linker-vl(anit-pd-1)-linker-ch的氨基酸序列如seq id no.9所示，vh(anti-pcsk9)-ch的氨基酸序列如seq id no.10所示，vl(anti-pcsk9)-cl的氨基酸序列如seq id no.12所示；

16、所述scfv-igg形式的双特异性抗体中，

17、vh(anti-pd-1)-linker-vl(anti-pd-1)-linker-vh(anti-pcsk9)-ch的氨基酸序列如seq id no.11所示，vl(anti-pcsk9)-cl的氨基酸序列如seq id no.12所示；

18、所述igg-scfv形式的双特异性抗体中，

19、vh(anti-pcsk9)-ch-linker-vh(anti-pd-1)-linker-vl(anti-pd-1)的氨基酸序列如seq id no.13所示，vl(anti-pcsk9)-cl的氨基酸序列如seq id no.12所示；

20、所述dvd-igg形式的双特异性抗体中，

21、vh(anti-pd-1)-linker-vh(anti-pcsk9)-ch的氨基酸序列如seq id no.14、seqid no.17所示，vl(anti-pd-1)-linker-vl(anti-pcsk9)-cl氨基酸序列如seq id no.15、seq id no.16、seq id no.18所示。

22、本发明的技术方案之二为提供一种核酸分子，编码如技术方案之一所述的抗pd-1和pcsk9的双特异性抗体。

23、本发明的技术方案之三为提供一种表达载体，包含如技术方案之二所述的核酸分子。

24、本发明的技术方案之四为提供一种宿主细胞，包含如技术方案之三所述的表达载体。

25、本发明的技术方案之五为提供一种药物组合物，包含如技术方案之一所述的抗pd-1和pcsk9的双特异性抗体，或如技术方案之二所述的核酸分子，或如技术方案之三所述的表达载体，或如技术方案之四所述的宿主细胞。

26、进一步地，所述药物组合物还包括一种或多种其它抗肿瘤药物。

27、本发明的技术方案之六为提供一种根据技术方案之一所述的抗pd-1和pcsk9的双特异性抗体，或根据技术方案之二所述的核酸分子，或根据技术方案之三所述的表达载体，或根据技术方案之四所述的宿主细胞，或根据技术方案之五所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

28、进一步地，所述肿瘤选自黑色素瘤、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、肝癌、胃癌、淋巴癌、乳腺癌、结直肠癌、肾癌、膀胱癌、白血病、前列腺癌或骨髓癌。所述肿瘤还包括其他赘生性恶性疾病。

29、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

30、本发明提供了一种抗pd-1/pcsk9双特异性抗体，实验结果显示抗pd-1/pcsk9双特异性抗体保持着和pd-1、pcsk9靶点的结合能力和活性，在细胞和小鼠试验上得到了很好的验证，且抗pd-1/pcsk9双特异性抗体的药效优于pcsk9单抗、pd-1单抗的药效及其联用的药效，并且抗pd-1/pcsk9双特异性抗体有着很好的稳定性和成药性。