胞外多糖明串珠菌及其发酵甜菜糖蜜生产胞外多糖的方法与流程

本发明属于微生物发酵，具体涉及一种高产胞外多糖的明串珠菌，及其利用该明串珠菌发酵甜菜糖蜜生产胞外多糖的方法。

背景技术：

1、甜菜糖蜜是甜菜制取蔗糖过程产生的高度浓缩褐色液体副产物，水分活度低，含有丰富的碳水化合物、氨基酸、矿质离子等可生物转化利用的营养成分。目前甜菜糖蜜的利用途径主要为加工畜牧业饲料，转化价值低。开发甜菜糖蜜的高值化产品是目前甜菜制糖产业链亟待拓展的重要方向，对于提高下游副产物附加值和综合经济效益具有重要意义。

2、微生物多糖较植物来源的多糖具有生产方便，不受栽培地气候等条件制约等优势，同时具有抗氧化、抗肿瘤、免疫调节、改善肠道菌群等诸多特殊生理活性，在发酵制品、保健品和医药等领域研究开发前景广阔。目前已报道的一些微生物具有合成葡萄糖聚合物的能力，其中乳酸菌(lactobacillus)、链球菌(streptococcus)和明串珠菌leuconostoc)等菌株可利用蔗糖合成葡聚糖，分子式为(c6h10o5)n。

3、其中，乳酸菌作为全球公认的对人体安全、可食用的一类细菌，是目前微生物多糖研究开发领域的热点。因此，利用产胞外多糖乳酸菌发酵转化甜菜糖蜜生产功能性乳酸菌胞外多糖，是一条进行甜菜糖蜜副产物增值加工利用的潜在途径。目前，国内外鲜见对此技术领域的相关文献资料报道。

4、乳酸菌胞外多糖产量低是限制规模工业化生产的重要瓶颈。影响乳酸菌胞外多糖产量的因素包括菌种遗传特性、培养基营养环境和发酵工艺条件等。

5、目前按在高纯度的蔗糖体系里生产多糖有所报导，但针对高盐、偏碱的糖蜜体系，菌种的耐受性和发酵性能受到挑战，获得具有优良发酵特性，能够适应甜菜糖蜜这种高盐基质环境的菌种，并高效转化甜菜糖蜜生产微生物多糖的乳酸菌菌株具有重要应用价值和意义。

6、因此，一种适应高盐、偏碱营养基质特性的高产胞外多糖明串珠菌及其利用该明串珠菌发酵甜菜糖蜜生产胞外多糖的方法对于甜菜糖蜜规模化高值转化利用具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种能够很好适应甜菜糖蜜基质环境，并高效利用甜菜糖蜜，转化生产胞外多糖的高产胞外多糖乳酸菌菌种及其发酵功能性胞外多糖的方法。

2、本发明的胞外多糖明串珠菌16s rrna序列为序列表中序列<210>1所示。

3、本发明的胞外多糖明串珠菌菌株已经保藏至中国普通微生物菌种保藏管理中心；保藏日期为：2022年11月4日；保藏名称为：苏奥古姆明串珠菌，拉丁文学名：leuconostocsuionicum(以下简称m1)，保藏编号为：cgmcc no.26046。

4、上述的胞外多糖明串珠菌m1是从中粮糖业控股股份有限公司所属糖厂的甜菜糖蜜副产物中分离得到，并经试验验证其在生产胞外多糖产品的应用中，能够很好适应甜菜糖蜜基质环境，并高效利用甜菜糖蜜，转化生产胞外多糖。

5、进一步地，本发明还提供了一种利用所述的产胞外多糖明串珠菌m1发酵制备胞外多糖的方法，该方法包括：将上所述胞外多糖明串珠菌m1菌种接种至含有甜菜糖蜜培养基种进行发酵，得到胞外多糖粗提物。

6、进一步地，本发明的利用所述的胞外多糖明串珠菌m1发酵制备胞外多糖的方法，具体步骤如下。

7、s1：从菌种保藏斜面挑取菌苔，接种于种子液体培养基中培养获得种子液。

8、s2：将步骤s1制备的种子液接种于含有甜菜糖蜜的发酵培养基中，培养获得发酵液。

9、s3：将s2获得的发酵液分离去除菌体，获得无细胞发酵液，加入乙醇进行沉淀，收集沉淀即为胞外多糖粗提物。

10、s4：将s3获得的胞外多糖粗提物通过冷冻干燥方式进行干燥。

11、进一步地，所述步骤s1中种子液体培养基包括以下常规mrs菌种培养基，优选的，其组成包括：蛋白胨5～30g，牛肉膏5～20g，酵母提取物3～10g，葡萄糖10～50g，ph 5.0～8.0。

12、进一步地，所述步骤s1中的培养条件为：培养温度20～45℃，培养时间5～20h，摇床转速10～200r/min。

13、进一步地，所述步骤s2中发酵培养基包括以下重量的成分，优选的，其组成包括：甜菜糖蜜100～500g，酵母提取物10～30g。所述发酵培养基的ph值为6.0～9.0。

14、进一步地，所述步骤s2中接种和培养条件为：接种量培养基体积的1％～10％进行接种，装液量200～900ml/l，培养温度25～45℃，初始ph值7～8，培养时间20～50h，摇床转速0～100r/min。

15、进一步地，所述步骤s3中粗多糖提取条件为：3000～10000r/min离心5～30min；所述乙醇浓度为60％～100％，乙醇与上清液的体积比为1:1～5:1。

16、进一步地，所述步骤s4中冷冻干燥条件为：冷阱温度-60～-30℃，真空度10～50pa，冻干时间24～96h。

17、进一步地，本发明还提供了一种胞外多糖的益生元配料，该配料含有如上所述的胞外多糖明串珠菌m1发酵所得胞外多糖，或者由上述的胞外多糖明串珠菌m1发酵所得。经过抗氧化性活性检测，发现该多糖具有良好的抗氧化性及益生菌发酵性能，具有开发益生元的潜力。

18、通过本发明的技术方案，能够获得如下的有益效果。

19、(1)本发明提供的胞外多糖明串珠菌m1具有较高的抗胁迫能力，可在9％v/v的高盐环境，菌株在高达60％浓度蔗糖环境中依然具备良好的生长繁殖能力，同时可以在较宽的酸、碱范围内生长繁殖区间，耐受ph可达8，胆盐耐受浓度可达0.15％，可保证胞外多糖的的正常发酵生产。

20、(2)与商业菌种cicc21725(肠膜明串珠菌，常用于泡菜一类生产中的发酵)相比，利用本发明胞外多糖明串珠菌m1生产出的胞外多糖优点在于，在糖蜜发酵生产过程中，其发酵速度快，本发明的胞外多糖明串珠菌m1的生长繁殖能力较强，延滞期较短，仅有2h，培养9h作用即可达到生长稳定期。

21、(3)通过检测评价，利用本发明提供胞外多糖明串珠菌m1所产的胞外多糖作为益生元。

22、(4)具有潜在的益生元产品潜力。将提取的胞外粗多糖以20g/l的添加量替代mrs培养基中葡萄糖，考察多糖的体外促益生菌增殖活性，发现本发明的胞外多糖明串珠菌m1生产的胞外粗多糖对5株益生菌均有不同程度的促生长增殖作用。充分地体现了所述胞外多糖明串珠菌m1生产胞外多糖促进益生菌生长的典型品质，表现出了良好的益生元潜力。

技术特征：

1.一种胞外多糖明串珠菌，其特征在于：菌株的dna为序列表中序列<210>1所示。

2.一种产胞外多糖明串珠菌的应用，其特征在于：将权利要求1所述的胞外多糖明串珠菌应用于生产胞外多糖产品。

3.根据权利要求2所述的产胞外多糖明串珠菌的应用，其特征在于：所述应用于生产胞外多糖产品为：用甜菜糖蜜生产获得的胞外多糖。

4.一种利用产胞外多糖明串珠菌发酵甜菜糖蜜生产胞外多糖的方法，其特征在于：包含：将所述胞外多糖明串珠菌接种至含有甜菜糖蜜的培养基中进行发酵，得到胞外多糖粗提物，具体步骤如下：

5.根据权利要求4所述的利用产胞外多糖明串珠菌发酵甜菜糖蜜生产胞外多糖的方法，其特征在于：

6.根据权利要求4所述的利用产胞外多糖明串珠菌发酵甜菜糖蜜生产胞外多糖的方法，其特征在于：所述步骤s1中的培养条件为：培养温度20～45℃，培养时间5～20h，摇床转速10～200r/min。

7.根据权利要求4所述的利用产胞外多糖明串珠菌发酵甜菜糖蜜生产胞外多糖的方法，其特征在于：所述步骤s2中发酵培养基包含以下重量的成分，甜菜糖蜜100～500g，酵母提取物10～30g。所述发酵培养基的ph值为6.0～9.0。

8.根据权利要求4所述的利用产胞外多糖明串珠菌发酵甜菜糖蜜生产胞外多糖的方法，其特征在于：所述步骤s2中接种和培养为：接种量培养基体积的1％～10％进行接种，培养温度25～45℃，初始ph值7～8，培养时间20～50h，摇床转速0～100r/min。

9.根据权利要求4所述的利用产胞外多糖明串珠菌发酵甜菜糖蜜生产胞外多糖的方法，其特征在于：所述步骤s3中粗多糖提取条件为：3000～10000r/min离心5～30min；所述乙醇浓度为60％～100％，乙醇与上清液的体积比为1:1～5:1。

10.根据权利要求4所述的利用产胞外多糖明串珠菌发酵甜菜糖蜜生产胞外多糖的方法，其特征在于：所述步骤s4中冷冻干燥条件为：冷阱温度-60～-30℃，真空度10～50pa，冻干时间24～96h。

技术总结
本发明涉及一种胞外多糖明串珠菌及其发酵甜菜糖蜜生产胞外多糖的方法，其胞外多糖明串珠菌M1的DNA为序列表中序列<210>1所示，将本发明的胞外多糖明串珠菌M1应用于生产胞外多糖产品中，特别是利用甜菜糖蜜生产胞外多糖的过程中，能够很好适应甜菜糖蜜的基质环境，并高效地利用甜菜糖蜜转化生产胞外多糖。

技术研发人员：赵抒娜,张菡,陈海军,申光辉,龙晓宇
受保护的技术使用者：中粮糖业控股股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15