一种栀子来源的植物纳米囊泡的制备方法

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种栀子来源的植物纳米囊泡的制备方法。

背景技术：

1、所有原核生物和真核生物的细胞都能够释放细胞外囊泡(extracellularvesicles，evs)。外泌体是直径范围为约30至200nm的细胞外囊泡。外泌体的产生可追溯为：细胞质膜的连续内陷导致多泡体(multivesicular body，mvb)的形成，多泡体可以与其他细胞内囊泡和细胞器相交，从而产生外泌体，这也导致外泌体成分的多样性。根据细胞来源的不同，外泌体可以包含许多细胞成分，包括dna、rna、脂质、代谢物以及细胞溶质和细胞表面蛋白。许多哺乳动物细胞有释放外泌体的能力，包括网织红细胞、树突状细胞、b细胞、t细胞、肥大细胞、上皮细胞、肿瘤细胞等。除了动物体液外，许多植物中也发现含蛋白质和小rna的外泌体样纳米粒子，如生姜、蓝莓、葡萄、香菇、哈密瓜、橙子、梨、柚子、大豆、豌豆、番茄等。

2、植物mvb分泌的外泌体样囊泡(植物纳米囊泡)，作为细胞间通讯和免疫调节的一种方法，可以保护植物免受病原体入侵。最重要的是，植物来源的外泌体样纳米颗粒(plant-derived exosome-like nanoparticles，pdens)被证明可以被肠道巨噬细胞吸收，并且能够通过诱导多种细胞因子来进行种间通讯。pdens的提取率远高于哺乳动物细胞培养，因此其在工业化大规模生产和应用上具有重要意义。

3、栀子(学名：gardenia jasminoides ellis)，别名：黄栀子、山栀、白蟾，是茜草科栀子属灌木，植物栀子的果实也称作“栀子”，是传统中药，属卫生部颁布的第1批药食两用资源，含有多种重要生物活性成分，包括以栀子苷、京尼平(栀子苷经β-葡萄糖苷酶水解后的产物)为主的环烯醚萜苷类和以藏红花苷为主的类胡萝卜素类，具有护肝利胆、降脂降糖降压、神经保护等作用。

4、目前，国内外对于栀子花的化学成分及香气成分的研究比较多。迄今为止，国内外研究学者已经从栀子花中分离得到环烯醚萜类、黄酮类、二萜类、三萜类、酚酸类和有机酸酯类等化学成分。并且对于栀子花的总黄酮提取工艺、栀子油的提取纯化工艺、栀子黄色素的提取工艺和氨基酸成分的分析测定也有所研究。但是，目前国内外对于栀子外泌体样纳米囊泡的研究几乎没有。

5、本发明填补了栀子来源的植物外泌体样纳米囊泡的空白，对栀子这一药食两用资源的深度利用进行了进一步的探索，并为其未来在医疗美容、药物递送、疾病治疗等方面的深入应用提供相关的参考和指导。

技术实现思路

1、基于现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种天然来源、安全可靠、生产成本较低、可大量生产的植物来源外泌体样纳米囊泡的制备方法。栀子果、栀子花来源的植物纳米囊泡既可以作为一种新型安全的保健食品，也可以作为一种低毒性、高生物相容性和生物利用度的药物载体。

2、本发明可以通过以下技术方案实现：

3、本发明提供了一种栀子来源的植物纳米囊泡的制备方法，包括以下步骤：

4、(1)将栀子原材料加入缓冲液后进行破碎，获得原浆；

5、(2)将步骤(1)中所得原浆进行多次离心，离心速度相同，每次离心后收集上清液进行下一次离心，最后一次离心后收集上清液；

6、(3)将步骤(2)最后一次离心后收集的上清液进行超速离心，收集沉淀；

7、(4)将步骤(3)所得沉淀用缓冲液重悬后进行密度梯度超速离心，收集各个密度层间的悬浮物；

8、(5)将步骤(4)收集的悬浮物用缓冲液重悬后再次进行超速离心，收集沉淀；

9、(6)将步骤(5)收集的沉淀用缓冲液重悬后过滤膜得到所述栀子来源的植物纳米囊泡，滤膜的孔径为0.1～0.5μm。

10、所述栀子为栀子果和/或栀子花。

11、优选的，步骤(1)中，破碎时使用榨汁机，榨汁机转速为1000～15000转/分钟，破碎时间为30～120秒。避免破碎过细、时长过长导致原浆凝胶化。

12、具体的，步骤(2)中，多次离心分为两次离心，离心温度为4℃，离心时间为每次20分钟，速度为20000×g，目的是将原浆中的果渣初步分离出来。

13、优选的，步骤(3)中，先将步骤(2)最后一次离心后收集的上清液进行抽滤，收集滤液；再将收集的滤液进行超速离心；其中，抽滤所用滤纸的孔径为0.45μm或0.22μm，以进一步提高步骤(3)和(5)中沉淀过膜时的收集效率。

14、优选的，步骤(3)和(5)中，超速离心的离心力为100000～170000×g，离心时间为60～180分钟。相对较低的转速可以提高生产安全性，相对较短的离心时间便于提高单位时间的产出率。

15、步骤(4)中，密度梯度超速离心以蔗糖、氯化铯、氯化铷或溴化铯为梯度材料；密度梯度的质量浓度分别为8％、30％、45％和60％。优选的，蔗糖为梯度材料可以有效提高生物安全性。

16、优选的，步骤(6)中，过滤膜时先过一道孔径为0.45μm的滤膜，再过一道孔径为0.22μm的滤膜。过两道膜可以降低膜被直接堵住的风险，提高利用率。

17、各步骤中缓冲液的ph范围为7.0～7.6；各步骤中的缓冲液为以下至少一种：磷酸盐缓冲液、tris缓冲液、tris-hcl缓冲液、tbs缓冲液、tbst缓冲液、te缓冲液和good's缓冲液。

18、所有离心相关操作在4～8℃环境中进行，减少因高速离心产生的热量导致纳米囊泡的破碎。

19、与现有技术相比，本发明具有制备方法简单、成本低、产量大等优点。植物来源的外泌体样纳米颗粒能够通过诱导多种细胞因子来进行种间通讯。拥有定位靶向能力高、无毒、热稳定性高、易被人体代谢降解、免疫原性低等优势。

技术特征：

1.一种栀子来源的植物纳米囊泡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述栀子来源的植物纳米囊泡的制备方法，其特征在于，所述栀子为栀子果和/或栀子花。

3.根据权利要求1所述栀子来源的植物纳米囊泡的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，破碎时使用榨汁机，榨汁机转速为1000～15000转/分钟，破碎时间为30～120秒。

4.根据权利要求1所述栀子来源的植物纳米囊泡的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，多次离心分为两次离心，两次离心的离心力均为20000×g，离心时间均为20分钟。

5.根据权利要求1所述栀子来源的植物纳米囊泡的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，先将步骤(2)最后一次离心后收集的上清液进行抽滤，收集滤液；再将收集的滤液进行超速离心。

6.根据权利要求1所述栀子来源的植物纳米囊泡的制备方法，其特征在于，步骤(3)和(5)中，超速离心的离心力为100000～170000×g，离心时间为60～180分钟。

7.根据权利要求1所述栀子来源的植物纳米囊泡的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，密度梯度超速离心以蔗糖、氯化铯、氯化铷或溴化铯为梯度材料；密度梯度的质量浓度分别为8％、30％、45％和60％。

8.根据权利要求1所述栀子来源的植物纳米囊泡的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，过滤膜时先过一道孔径为0.45μm的滤膜，再过一道孔径为0.22μm的滤膜。

9.根据权利要求1所述栀子来源的植物纳米囊泡的制备方法，其特征在于，各步骤中缓冲液的ph范围为7.0～7.6；

技术总结
本发明公开了一种栀子来源的植物纳米囊泡的制备方法，涉及生物工程领域。本发明具有制备方法简单、成本低、产量大等优点。植物来源的外泌体样纳米颗粒能够通过诱导多种细胞因子来进行种间通讯。拥有定位靶向能力高、无毒、热稳定性高、易被人体代谢降解、免疫原性低等优势。

技术研发人员：徐李舟,王豪波
受保护的技术使用者：浙江大学杭州国际科创中心
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15