一种高效富组氨酸蛋白质分离色谱材料P(NIPAM-co-AAc)-PAMAM@Cu及其制备方法

本发明属于功能高分子色谱材料，具体涉及一种高效富组氨酸蛋白质分离色谱材料p(nipam-co-aac)-pamam@cu及其制备方法。

背景技术：

1、蛋白质药物具有活性高、特异性强、毒性低、功能明确等特点。近年来，随着基因工程技术的发展，蛋白质药物的开发和需求与日俱增，已成为医药产品中的重要组成部分。由于该类生物制品对活性和纯度的要求极其严格，因此高效的分离纯化技术成为了获取这类生物制品的关键。

2、蛋白质分离纯化方法主要有盐析法，沉淀法，透析与过滤法，电泳法，层析法等。其中层析法具有选择性好，条件温和，分离纯度高等特点，是生物分子分离纯化的重要工具，已在现代生物高技术产品的产业化过程中大规模应用。色谱分离技术的发展依赖于吸附介质，其中根据某些蛋白质与另一种配体分子能特异而非共价地结合进行分离是一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使目标蛋白从复杂的混合物中分离出来，且具有较高的纯度。如金属螯合分离介质，利用ni、zn、cu等二价金属离子能够与蛋白质分子外露的组氨酸等残基簇，将目标蛋白吸附在介质上，达到特异吸附的目的。

3、目前，国内一些课题组对相关色谱介质的载体开发主要集中在壳聚糖、琼脂糖、二氧化硅等，其富组氨酸类蛋白质最大吸附容量主要集中在100-350mg/g，与国外相比仍有一定的差距。因此，亟需制备一种具有高容量，高分辨率和选择性的蛋白质分离介质，为蛋白质药物分离提供一种新的有效途径。

4、聚n-异丙基丙烯酰胺是一类具有三维网络结构的温敏性水凝胶，具有良好的吸水性和生物相容性，被广泛用于药物输送、废水处理等领域，在负载容量上具有明显的优势。但因其本身响应速度慢，功能基不足、特异性差等问题，使其在蛋白质分离方面的应用受到了极大的限制。超支化聚酰胺胺是一种具有树枝状三维网络结构的聚合物，其分子内部有大量空腔并且外围末端有很多活性胺基，且其分子结构能够通过调控聚合过程而进行有效控制，是一种理想的色谱介质间隔臂。因此，利用两亲性凝胶和间隔臂的高负载性，以及金属配基特异性双重作用，制备一类具有高容量，高分辨率和选择性的蛋白质分离介质，为我国生物技术的发展服务，具有巨大的现实意义和经济效益。

技术实现思路

1、本发明的目的是：解决现有技术中存在的问题，提供一种高效富组氨酸蛋白质分离色谱材料p(nipam-co-aac)-pamam@cu及其制备方法，利用两亲性凝胶和间隔臂的高负载性，以及金属配基特异性双重作用，使得蛋白质分离介质具有高容量、高分辨率和选择性，能够为蛋白质药物分离提供了一种新的有效途径。

2、为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：一种高效富组氨酸蛋白质分离色谱材料p(nipam-co-aac)-pamam@cu的制备方法，包括以下步骤：

3、s1：p(nipam-co-aac)-pamam的制备：

4、将p(nipam-co-aac)水凝胶、功能基(pamam)和蒸馏水置于烧瓶中，在n2保护下进行冷凝回流，反应结束后冷却至室温，将产物用去离子水反复洗涤纯化，得到淡黄色凝胶状固体p(nipam-co-aac)-pamam，其中p(nipam-co-aac)水凝胶和功能基(pamam)中naac:npamam＝1:1；

5、s2：色谱材料p(nipam-co-aac)-pamam@cu的制备：

6、将上述步骤s1中制备得到的淡黄色凝胶状固体和硝酸铜溶液置于烧瓶中，其中淡黄色凝胶状固体的投入量为0.2～1.4g/l，调节ph值为1～5，后置于恒温水浴摇床中振荡，吸附时间为10～60min，反应结束后最终得到色谱材料p(nipam-co-aac)-pamam@cu。

7、所述步骤s1中，p(nipam-co-aac)水凝胶通过以下方法制备：

8、将引发剂，交联剂和单体置于三口烧瓶中，加入蒸馏水，在n2保护下冷凝回流，反应结束后冷却至室温，将产物用去离子水反复洗涤纯化，得到白色凝胶状固体p(nipam-co-aac)；

9、其中引发剂为偶氮二异丁腈(aibn)，交联剂为n,n-亚甲基双丙烯酰胺(mba)，单体由摩尔量比为1:0.1～1的n-异丙基丙烯酰胺(nipam)和丙烯酸(aac)组成；

10、p(nipam-co-aac)水凝胶的工艺合成路线如下：

11、

12、所述步骤s1中，功能基(pamam)通过以下方法制备：

13、s11、将乙二胺和甲醇于三口烧瓶中，用恒压滴液漏斗向三口烧瓶中加入丙烯酸甲酯，在25℃度下磁力搅拌24h，反应结束后，旋蒸过量的甲醇和丙烯酸甲酯，得反应产物1；

14、s12、将上述反应产物1和甲醇加入三口烧瓶中，在25℃下用恒压滴液漏斗向三口烧瓶中加入乙二胺，反应24h，旋蒸过量的甲醇和乙二胺，得到淡黄色粘稠状物质功能基(pamam)；

15、功能基(pamam)的工艺合成路线如下：

16、

17、所述步骤s2中，优选的，淡黄色凝胶状固体的投入量为0.8g/l，调节ph值为5，吸附时间为60min。

18、本发明还提供一种利用上述的制备方法制备得到的色谱材料p(nipam-co-aac)-pamam@cu，应用在富组氨酸蛋白质。

19、本发明的有益效果是：

20、1)本发明利用两亲性凝胶和间隔臂的高负载性，以及金属配基特异性双重作用，使得蛋白质分离介质具有高容量、高分辨率和选择性，能够为蛋白质药物分离提供了一种新的有效途径。

21、2)本发明中合成的pamam是一种具有树枝状网络结构的聚合物，其分子内部有大量空腔，且外围末端有很多活性胺基，将pamam引入pnipam基水凝胶中能够有效增加活性位点，提高其吸附能力。

22、3)本发明的制备方法中利用p(nipam-co-aac)-pamam水凝胶与cu2+螯合，制备了对富组氨酸蛋白质具有大容量和高选择性的色谱材料p(nipam-co-aac)-pamam@cu，在最佳分离条件下，p(nipam-co-aac)-pamam@cu对bhb、bsa、lyz的平衡吸附量分别为646.23mg/g、108.33mg/g和56.24mg/g。

技术特征：

1.一种高效富组氨酸蛋白质分离色谱材料p(nipam-co-aac)-pamam@cu的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种高效富组氨酸蛋白质分离色谱材料p(nipam-co-aac)-pamam@cu的制备方法，其特征在于：所述步骤s1中，p(nipam-co-aac)水凝胶通过以下方法制备：

3.根据权利要求1所述的一种高效富组氨酸蛋白质分离色谱材料p(nipam-co-aac)-pamam@cu的制备方法，其特征在于：所述步骤s1中，功能基(pamam)通过以下方法制备：

4.根据权利要求1所述的一种高效富组氨酸蛋白质分离色谱材料p(nipam-co-aac)-pamam@cu的制备方法，其特征在于：所述步骤s2中，优选的，淡黄色凝胶状固体的投入量为0.8g/l，调节ph值为5，吸附时间为60min。

5.一种利用权利要求1～4中任一所述的制备方法制备得到的色谱材料p(nipam-co-aac)-pamam@cu。

技术总结
本发明公开了一种高效富组氨酸蛋白质分离色谱材料P(NIPAM‑co‑AAc)‑PAMAM@Cu及其制备方法，属于功能高分子色谱材料技术领域；其制备方法包括以下步骤：以偶氮二异丁腈(AIBN)为引发剂，N,N‑亚甲基双丙烯酰胺(MBA)为交联剂，N‑异丙基丙烯酰胺(NIPAM)和丙烯酸(AAc)为单体，聚酰胺胺(PAMAM)为功能基，制备P(NIPAM‑co‑AAc)‑PAMAM水凝胶，与硝酸铜螯合后，最终制备得到色谱材料P(NIPAM‑co‑AAc)‑PAMAM@Cu。由本发明制备的色谱材料，在一定条件下，对BHb、BSA、Lyz的平衡吸附量分别为646.23mg/g、108.33mg/g和56.24mg/g，对富组氨酸蛋白质具有吸附容量大、选择性高的优势；且该色谱材料具有良好的分离性能和循环再生性，为富组氨酸蛋白质的分离纯化提供了一种新途径。

技术研发人员：朱卫霞,曹雅楠,屠凯,刘沛鑫
受保护的技术使用者：郑州大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15