一种脑源性神经前体细胞培养的方法与流程

本发明涉及细胞生物，具体为一种脑源性神经前体细胞培养的方法。

背景技术：

1、神经前体细胞是指界于神经干细胞和神经元细胞之间的一种神经细胞，它具有分化成神经元细胞的能力，并且具有神经干细胞多向分化的能力，神经前体细胞具有同神经干细胞类似的干性功能。

2、神经干细胞在动物中枢神经系统中广泛存在，但是含量极低。目前神经干细胞获取的主要来源是通过ips诱导，反向诱导需要外源病毒基因的引入，这种外源病毒引入所带来的风险是难以避免的，因此，神经干细胞依然存在着获取来源受限，原代细胞来源相对较少的问题，神经前体细胞具有同神经干细胞类似的分化潜能，是神经干细胞最好的替代型细胞。

3、如专利号为cn103013918a所述的脑神经干细胞的原代细胞的分离传代培养方法和专利号为cn106479979a所述的6种不同脑功能区脑神经干细胞的制备方法，均通过提取脑神经干细胞实现相应功能，这虽然可以快速大量获得与神经干细胞功能类似的神经前体细胞的方法，但是其对于脑部不同功能区细胞都是采用单独培养的方式，这样不仅操作麻烦，而且无法得到自然生长环境下的优良神经前体细胞，在进行病菌与对应神经前提细胞的影响判断时，无法得到更为精准的判断。

技术实现思路

1、（一）解决的技术问题

2、针对现有技术的不足，本发明提供了一种脑源性神经前体细胞培养的方法，解决了单独培养获取神经前体细胞的方式，不仅操作麻烦，而且无法得到自然生长环境下的优良神经前体细胞的问题。

3、（二）技术方案

4、为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种脑源性神经前体细胞培养的方法，具体包括以下步骤：

5、一种脑源性神经前体细胞培养的方法，具体包括以下步骤：

6、步骤一、细胞获取：选用向不同脑功能区发育的sd大鼠胚胎脑组织，利用吹打法将对应脑组织用吸管吹打成细胞悬液，用200目筛网过滤，经台盼蓝染色后进行观测至镜下可见单个细胞或者2-3个细胞微团，计数测定存活细胞比例，根据存活细胞比例调整细胞悬液的细胞浓度，再将细胞悬液按1×105个/ml接种至一定数量的培养瓶并增殖后，取5个40×视野计算镜下增殖后的平均细胞数目，并按镜下面积与培养瓶面积的比例结合总培养瓶数进行数目计算，得到总细胞数目；

7、步骤二、环境构建：构建大型培养皿（1），用隔板（3）分隔出一定数量的培养室（4），在培养室（4）中放置定位培养皿（6），大型培养皿（1）的中部设有加注筒（2），加注筒（2）的表面设有与培养室（4）连通的槽口（5）；

8、步骤三、协同培养：在定位培养皿（6）中放入垫板培养筒（7），向加注筒（2）中加入培养液，至培养液通过槽口（5）流入到定位培养皿（6），并进入到垫板培养筒（7）中，此时将所述步骤一中获得的向不同脑功能区发育的脑组织细胞悬液分别接种到步骤二中不同的垫板培养筒（7）中，将大型培养皿（1）放置于培养箱中培养；

9、步骤四、传代培养：在进行所述步骤三的培养过程中，1-2d后更换大型培养皿（1）并进行半量补液，3-4d后根据细胞生长情况半量换液，5-6d后在大型培养皿（1）中进行传代培养。

10、优选地，所述步骤一中的脑功能区包括大脑、小脑和脑干，其中大脑包括左脑和右脑，小脑包括延脑、桥脑和中脑。

11、优选地，所述步骤三中培养箱中的环境为3.5%二氧化碳、37℃。

12、优选地，所述步骤三中的培养液采用基础培养基由dmem/f12加入表皮细胞生长因子egf、碱性成纤维细胞生长因子bfgf和肝素后制得。

13、优选地，所述培养液中表皮细胞生长因子egf和碱性成纤维细胞生长因子bfgf终浓度在5-25ng/ml，肝素含量在0.001-0.0001%。

14、优选地，所述步骤二具体为：

15、构建一个大型培养皿（1），在大型培养皿（1）内腔中部固定安装一个加注筒（2），同时在加注筒（2）外周和大型培养皿（1）之间间隔均匀的固定安装至少六个隔板（3），利用隔板（3）将大型培养皿（1）内腔分隔出六个培养室（4），并且在加注筒（2）的表面开设出与培养室（4）连通的槽口（5），在培养室（4）中放置定位培养皿（6）。

16、通过采用上述技术方案，根据不同脑功能区提取出对应位置的细胞悬液后，构建出适应多个脑功能区提取细胞悬液同步培养的大型培养皿，以培养液为共同接触介质，有效模拟细胞的自然生长环境，保证最终得到神经前体细胞的优良性，通过加入肝素成分，大大降低了传统神经前体细胞在培养过程中容易聚集成球，导致细胞球中心细胞由于不能获取营养成分而死亡，最终影响细胞活率及质量的问题。

17、（三）有益效果

18、本发明提供了一种脑源性神经前体细胞培养的方法，具备以下有益效果：

19、（1）本发明通过根据不同脑功能区提取出对应位置的细胞悬液后，构建出适应多个脑功能区提取细胞悬液同步培养的大型培养皿，以培养液为共同接触介质，有效模拟细胞的自然生长环境，保证最终得到神经前体细胞的优良性；

20、（2）本发明通过加入肝素成分，大大降低了传统神经前体细胞在培养过程中容易聚集成球，导致细胞球中心细胞由于不能获取营养成分而死亡，最终影响细胞活率及质量的问题。

技术特征：

1.一种脑源性神经前体细胞培养的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种脑源性神经前体细胞培养的方法，其特征在于：所述步骤一中的脑功能区包括大脑、小脑和脑干，其中大脑包括左脑和右脑，小脑包括延脑、桥脑和中脑。

3.根据权利要求1所述的一种脑源性神经前体细胞培养的方法，其特征在于：所述步骤三中培养箱中的环境为3.5%二氧化碳、37℃。

4.根据权利要求1所述的一种脑源性神经前体细胞培养的方法，其特征在于：所述步骤三中的培养液采用基础培养基由dmem/f12加入表皮细胞生长因子egf、碱性成纤维细胞生长因子bfgf和肝素后制得。

5.根据权利要求4所述的一种脑源性神经前体细胞培养的方法，其特征在于：所述培养液中表皮细胞生长因子egf和碱性成纤维细胞生长因子bfgf终浓度在5-25ng/ml，肝素含量在0.001-0.0001%。

6.根据权利要求1所述的一种脑源性神经前体细胞培养的方法，其特征在于：所述步骤二具体为：

技术总结
本发明涉及细胞生物技术领域，公开了一种脑源性神经前体细胞培养的方法，具体包括以下步骤：步骤一、细胞获取；步骤二、环境构建；步骤三、协同培养；步骤四、传代培养；该脑源性神经前体细胞培养的方法，根据向不同脑功能区发育的脑组织提取出对应位置的细胞悬液后，构建出适应多个对应脑功能区位置提取细胞悬液同步培养的大型培养皿，以培养液为共同接触介质，有效模拟细胞的自然生长环境，保证最终得到神经前体细胞的优良性，更为贴合脑部环境的同时，判断结果更为精准。

技术研发人员：张世冬
受保护的技术使用者：中科聚研干细胞有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13