一种减少气溶胶污染的重组Bst-UNG酶及其编码基因的制作方法

本发明实施例涉及生物，具体涉及一种减少气溶胶污染的重组bst-ung酶及其编码基因。

背景技术：

1、环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，lamp)是notomi等人于2000年提出来的一种新的核酸扩增技术，已被广泛地应用于病原微生物检测和传染性疾病诊断等领域。反应原理为，当fip的f2区与靶dna的f2c区结合并启动互补链合成时，扩增开始，然后f3引物结合到靶dna的f3c区并延伸，置换fip连接的互补链。这条互补的链在5'端形成一个环作为bip的模板。b2结合到到模板dna的b2c区域。dna合成开始形成互补链并打开5'端环。随后，b3结合到靶dna的b3c区域并延伸，取代bip连接的互补链。这样会形成一个哑铃状dna。核苷酸通过bstdna聚合酶添加到f1的3'端，其延伸并打开5'端的环。哑铃形状的dna现在被转化为茎环结构，该结构用作lamp循环的引发剂，开始lamp反应的第二阶段，用于lamp的指数扩增。获得的最终产物是具有不同茎长度的茎环dna和具有多个环的各种花头菜样结构的混合物。

2、由于lamp反应自身灵敏度较高，容易受到气溶胶的污染，出现检测假阳性。鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、为此，本发明实施例提供一种减少气溶胶污染的重组bst-ung酶。cod ung酶能够选择性水解双链或单链dna中尿嘧啶与脱氧核糖之间的n-糖苷键，形成缺失一个碱基位点(无嘧啶)的dna链，在碱性溶液及高温条件下会进一步水解断裂，从而被完全水解；且codung酶对rna中的尿嘧啶无活性。本发明将bst dna聚合酶和ung酶进行融合，一次性加入表达的酶可以减少加入试剂的次数，从而减少气溶胶污染。

2、为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

3、根据本发明实施例的第一方面，提供一种编码减少气溶胶污染的重组bst-ung酶的基因，所述基因的核苷酸序列包括：

4、用于编码bst dnapolⅰ蛋白的如seq id no:1所示的核苷酸序列；和，

5、用于编码cod ung蛋白的如seq id no:2所示的核苷酸序列。

6、bst dna聚合酶大片段(bst dna polⅰ)是bacillus stearothermophilus dna聚合酶的一部分，来源于e.coli菌株，利用基因重组技术，在大肠杆菌中进行表达后经多次纯化分离而得，该酶具有5'→3'dna聚合酶活性，但不具有5'→3'外切核酸酶活性。发明人发现，将bst dnapolⅰ核苷酸序列中51a>c(seq id no:1)，能够增加bst dnapolⅰ5'→3'dna聚合酶活性，提高扩增效率，缩短反应时间，最大程度减少气溶胶污染。

7、进一步地，所述seq id no:1所示的核苷酸序列和seq id no:2所示的核苷酸序列通过柔性linker融合连接，所述柔性linker的核苷酸序列为：ggcggcggcggcagcggcggcggcggctcg。

8、根据本发明实施例的第二方面，提供一种减少气溶胶污染的重组bst-ung酶，所述重组bst-ung酶由如上所述的基因编码得到。

9、根据本发明实施例的第三方面，提供一种表达载体，所述表达载体含有如上所述的基因。

10、根据本发明实施例的第四方面，提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如上所述的基因，或如上所述的表达载体。

11、根据本发明实施例的第五方面，提供如上所述的基因、如上所述的重组bst-ung酶、如上所述的表达载体，或如上所述的宿主细胞在环介导等温扩增中的应用。

12、本发明实施例具有如下优点：

13、本发明提供的重组bst-ung酶可以很好的扩增lamp反应，能有效增加聚合酶的扩增效率，与此同时，一次性加入表达的酶可以减少添加试剂的次数，减少长时间开盖引起的气溶胶污染可能性，最大程度防止气溶胶污染。

技术特征：

1.一种编码减少气溶胶污染的重组bst-ung酶的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列包括：

2.根据权利要求1所述的编码减少气溶胶污染的重组bst-ung酶的基因，其特征在于，所述seq id no:1所示的核苷酸序列和seq id no:2所示的核苷酸序列通过柔性linker融合连接，所述柔性linker的核苷酸序列为：ggcggcggcggcagcggcggcggcggctcg。

3.一种减少气溶胶污染的重组bst-ung酶，其特征在于，所述重组bst-ung酶由权利要求1或2所述的基因编码得到。

4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有如权利要求1或2所述的基因。

5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有如权利要求1或2所述的基因，或如权利要求4所述的表达载体。

6.权利要求1或2所述的基因、权利要求3所述的重组bst-ung酶、权利要求4所述的表达载体，或权利要求5所述的宿主细胞在环介导等温扩增中的应用。

技术总结
本发明实施例公开了一种减少气溶胶污染的重组Bst‑UNG酶及其编码基因，所述基因的核苷酸序列包括：用于编码BstDNAPOLⅠ蛋白的如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；和，用于编码CodUNG蛋白的如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。本发明提供的重组BSt‑UNG酶可以很好的扩增LAMP反应，可以有效增加聚合酶的扩增效率，与此同时，一次性加入表达的酶可以减少加入试剂的次数，减少长时间开盖引起的气溶胶污染可能性。

技术研发人员：郝立颖,彭勇,韩豪杰
受保护的技术使用者：北京世纪沃德生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15