一种提高哺乳动物克隆技术效率的方法及Wnt通路抑制剂的应用与流程

本发明涉及基因工程，具体地说，是关于一种提高哺乳动物克隆技术效率的方法及wnt通路抑制剂的应用。

背景技术：

1、哺乳动物体细胞核移植技术是唯一能将体细胞基因组重编程为全能性胚胎的工程技术，对动物物种资源保存、畜牧业发展及生物再生医学研究等具有极其广阔的应用前景。尽管该技术已经取得了许多研究进展，但长期以来体细胞核移植的效率一直较低，这其中体细胞重编程异常或者不完全被认为是造成核移植低效的重要原因，主要表现为dna甲基化和组蛋白甲基化修饰的异常建立和长链非编码rnaxist的双等位异常表达等。

2、而目前对于提高克隆效率的方法大多通过对重编程过程的障碍进行研究，以帮助打破重编程的壁垒。例如，早期的研究发现核移植胚胎通过去乙酰化抑制剂(tsa或者scriptaid)处理可修复h3k9ac修饰缺陷并提高核移植胚胎发育效率[1-3]。另一个重要发现是日本riken研究所ogura实验室发现核移植胚胎会出现xist的异常表达，引起核移植胚胎x染色体的异常失活，从而造成胚胎发育缺陷[4-5]。而利用xist基因敲除的体细胞作为供体细胞，其克隆出生率可提高8-10倍。另外，来自哈佛医学院的张毅实验室和我们实验室，都通过对核移植的早期胚胎的重编程机制进行研究，鉴定出了一个对于重编程过程中重要的组蛋白修饰障碍h3k9me3[6-7]。通过联合过表达组蛋白去甲基化酶kdm4b/kdm4d和kdm5b可将核移植胚胎的囊胚率提高到和体外受精几乎同样的水平(95％左右)，但大部分的克隆胚胎都会发生早期流产[8]。最近，多个实验室通过基因编辑手段修复h3k27me3修饰介导的基因印记在克隆胚胎的植入后胎盘中的异常表达可挽救胎盘肥大异常[9-11]。除此以外，我们实验室还发现干扰dna甲基化转移酶的表达可有效降低4-cell时期克隆胚胎中异常dna再甲基化水平，提升克隆胚胎的体内外发育效率[8]。

3、虽然目前现有的手段能够大幅度地提高核移植胚胎的囊胚率，但克隆胚胎最终的出生率仍然明显低于正常受精胚胎。与正常受精胚胎相比，大部分的克隆胚胎在围着床期出现植入失败或早期流产。这表明除了已知的重编程因素之外，还有其他的未知障碍抑制了核移植胚胎的正常发育。回顾核移植技术的发展历程，几乎所有的研究主要集中于对植入前期和植入后期克隆胚胎发育异常的探索，对克隆胚胎围着床期植入失败和早期流产问题的研究较少，其机制也很不清楚。所以，亟需对克隆胚胎围着床期的发育调控机制的研究并探索针对性的干预方法。另一方面。现有提高体细胞克隆效率的技术大部分依赖基因过表达、基因敲降或基因敲除，需要制备特殊供体细胞系或额外的显微注射，操作复杂且对胚胎有一定损伤，缺乏简单易行的干预方法，如在培养液中添加小分子化合物改善克隆胚胎发育的方法。而目前如本发明的一种通过改善围着床期胚胎发育提高哺乳动物克隆技术效率的方法及wnt通路抑制剂的应用还未见报道。

技术实现思路

1、本发明的目的是，针对现有技术中的不足，提供一种提高哺乳动物克隆技术效率的方法以及wnt通路抑制剂。

2、一方面，提供了一种提高哺乳动物克隆技术效率的方法，所述方法是通过改善围着床期胚胎发育来提高哺乳动物克隆技术效率。

3、作为一个优选例，上述改善围着床期胚胎发育是通过在胚胎培养液中添加wnt通路抑制剂修复核移植胚胎围着床期发育障碍。

4、更优选地，所述wnt通路抑制剂为小分子化合物，所述抑制剂为iwp2或iwr1-endo。

5、第二方面，提供了wnt通路抑制剂在制备提高核移植胚胎的围着床期发育能力和出生率以及哺乳动物克隆技术效率产品中的应用。

6、作为一个优选例，上述wnt通路抑制剂为小分子化合物，所述抑制剂为iwp2或iwr1-endo。

7、更优选地，上述wnt通路抑制剂在植入前胚胎培养使用还能与其他表观修复方式协同作用进一步提升核移植胚胎的出生率。

8、更优选地，上述的表观修复方式包括h3k9me3去甲基化修饰酶kdm4b和dna甲基化的干扰rna(sidnmt3a/b)以及xist杂合敲除的供体细胞。

9、更优选地，所述的h3k9me3去甲基化修饰酶kdm4b和dna甲基化的干扰rna(sidnmt3a/b)促进核移植胚胎植入前发育，所述xist杂合敲除的供体细胞促进核移植胚胎植入后发育。

10、第三方面，提供了上述任一所述的方法在动物物种资源保存、畜牧业繁殖及再生医学研究中的应用。

11、本发明优点在于：

12、1、本发明通过改善的囊胚模拟着床体系可对核移植胚胎进行围着床期胚胎的体外培养，评估核移植胚胎围着床期发育的表型观察及机制研究，发现克隆胚胎植入失败和早期流产的重要原因是wnt通路异常激活，抑制植入前胚胎培wnt通路能改善克隆胚胎发育。

13、2、植入前胚胎培养时通过添加wnt抑制剂iwp2或者iwr1-endo，可有效提升核移植胚胎的围着床期发育能力和出生率；植入前胚胎培养时使用wnt抑制剂能与其他表观修复方式协同作用，进一步提升核移植胚胎的出生率。

14、3、本发明通供了一种简单易行的能显著提高哺乳动物核移植效率的方法，在动物物种资源保存、畜牧业繁殖及再生医学研究等具有广阔的应用前景。

技术特征：

1.一种提高哺乳动物克隆技术效率的方法，其特征在于，所述方法是通过改善围着床期胚胎发育来提高哺乳动物克隆技术效率。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述改善围着床期胚胎发育是通过在胚胎培养液中添加wnt通路抑制剂修复核移植胚胎围着床期发育障碍。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述wnt通路抑制剂为小分子化合物，所述抑制剂为iwp2或iwr1-endo。

4.wnt通路抑制剂在制备提高核移植胚胎的围着床期发育能力和出生率以及哺乳动物克隆技术效率产品中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述wnt通路抑制剂为小分子化合物，所述抑制剂为iwp2或iwr1-endo。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述wnt通路抑制剂在植入前胚胎培养使用还能与其他表观修复方式协同作用进一步提升核移植胚胎的出生率。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的表观修复方式包括h3k9me3去甲基化修饰酶kdm4b和dna甲基化的干扰rna(sidnmt3a/b)以及xist杂合敲除的供体细胞。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的h3k9me3去甲基化修饰酶kdm4b和dna甲基化的干扰rna(sidnmt3a/b)促进核移植胚胎植入前发育，所述xist杂合敲除的供体细胞促进核移植胚胎植入后发育。

9.权利要求1-3任一所述的方法在动物物种资源保存、畜牧业繁殖及再生医学研究中的应用。

技术总结
本发明涉及一种提高哺乳动物克隆技术效率的方法及Wnt通路抑制剂的应用。本发明发现WNT通路异常激活是导致克隆胚胎植入失败和早期流产的重要原因，通过在胚胎培养液中添加WNT通路小分子抑制剂修复核移植胚胎围着床期发育障碍，进一步提高了体细胞核移植胚胎的发育。通过对围着床期正常及体细胞核移植胚胎发育过程中的调控机制进行深入研究，我们揭示了核移植胚胎发育异常的表观修饰调控、转录因子调控及信号通路调控机制。明确WNT通路异常激活是核移植胚胎在围着床期发育异常的关键障碍，并利用WNT通路小分子抑制剂修复核移植胚胎围着床期发育过程的障碍，进一步提高了体细胞核移植技术的效率。

技术研发人员：高绍荣,刘文强,李延鹤,高帅,郑彩宏,刘营东,张亚林,贾艳平,殷吉庆
受保护的技术使用者：上海市第一妇婴保健院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15