一种环状长单链DNA制备方法与流程

本发明涉及核酸，具体涉及一种环状长单链dna制备方法。

背景技术：

1、环状dna具有线性dna不具备的动力学和拓补学特点，因此环状单链dna在分子生物和dna纳米技术、生物医药等领域有着广发的应用前景。目前常用基于circligase或t4dna ligase及辅助dna制备环状单链dna的方法得率低、易产生多聚体副产物，随着底物dna链长度的增大，催化成环的效率急剧降低，如何高效率地制备环状长单链dna及如何进行大批量环状dna的制备是环状dna制备面临的两大难题。

2、切刻酶是一种能特异性的识别双链dna的特定序列并对其中的一条链进行切割，产生缺口的限制性内切酶；sbi公司开发的minicircle dna制备试剂盒中，菌株zycy10p3s2t e.coli，在阿拉伯糖调控启动子的调控下表达phic31整合酶和iscei限制性内切酶，phic31重组酶系统特异性介导attp位点attb位点之间的重组，生成包含attl的骨架dna和包含attr的目的基因dna，iscei作用于包含attl的骨架dna部分(含有8个iscei识别位点)，将其线性化，随后被大肠杆菌体内的核酸酶降解，保留包含attr的目的基因dna，最后从细菌体内提取纯化。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种环状长单链dna制备方法，解决以下技术问题：

2、现有的技术中基于circligase或t4 dna ligase及辅助dna制备环状单链dna的方法得率低、易产生多聚体副产物，随着底物dna链长度的增大，催化成环的效率急剧降低。

3、本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

4、一种环状长单链dna制备方法，包括如下步骤：

5、s1：构建pmc.cirdna载体，pmc.cirdna载体上包括attb元件、attp元件以及诱导型启动子；

6、s2：在attb元件后添加nt.bspqi识别位点，attp元件前添加nb.bsrdi识别位点；

7、s3：将目的dna克隆至pmc.cirdna载体bspqi识别位点与bsrdi识别位点之间；

8、s4：测序验证正确后转化至宿主细胞中过夜培养；

9、s5：通过用与诱导型启动子对应的诱导剂诱导表达后提取粗品minicircledna；

10、s6：粗品minicircle dna纯化得到高纯度minicircle dna；

11、s7：nt.bspqi或nb.bsrdi酶切高纯度minicircle dna，使微环dna产生缺口；并利用exoⅰ核酸外切酶消化线性化单链dna，纯化后获取得到环状长单链dna。

12、作为本发明的进一步方案：所述宿主细胞为zycy10p3s2t e.coli细胞。

13、作为本发明的进一步方案：所述nt.bspqi识别位点的核苷酸序列为gaagagc。

14、作为本发明的进一步方案：所述nb.bsrdi识别位点的核苷酸序列为gcaatg。

15、作为本发明的进一步方案：所述诱导型启动子为阿拉伯糖启动子，所述诱导剂为阿拉伯糖。

16、作为本发明的进一步方案：s6中纯化具体步骤为：用骨架特异性限制内切酶及核酸外切酶除未亲本质粒及基因组dna获得高纯度minicircle dna。

17、作为本发明的进一步方案：pmc.cirdna载体的核苷酸序列如seq id no:1所示，具体如下：

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21、本发明的有益效果：

22、本申请改造了一种minicircle dna制备pmc.cirdna载体，并在pmc.cirdna载体上设置nt.bspqi识别位点、nb.bsrdi识别位点，目的dna克隆至pmc.cirdna载体bspqi识别位点与bsrdi识别位点之间；其在宿主细胞中在诱导剂诱导转化后，目的基因以及切刻酶诱导表达，并用骨架特异性限制内切酶及核酸外切酶除未亲本质粒及基因组dna获得高纯度minicircle dna。nt.bspqi或nb.bsrdi酶切高纯度minicircle dna，使微环dna产生缺口；并利用exoⅰ核酸外切酶消化线性化单链dna，纯化后获取得到环状长单链dna。本发明建立了由pmc.cirdna、切刻酶获取环状ssdna的流程，利用此方法可在30日内制备100-8000nt，2ug-10mg的环状ssdna。

技术特征：

1.一种环状长单链dna制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种环状长单链dna制备方法,其特征在于，所述宿主细胞为zycy10p3s2t e.col i细胞。

3.根据权利要求1所述的一种环状长单链dna制备方法,其特征在于，所述nt.bspq i识别位点的核苷酸序列为gaagagc。

4.根据权利要求1所述的一种环状长单链dna制备方法,其特征在于，所述nb.bsrdi识别位点的核苷酸序列为gcaatg。

5.根据权利要求1所述的一种环状长单链dna制备方法,其特征在于，所述诱导型启动子为阿拉伯糖启动子，所述诱导剂为阿拉伯糖。

6.根据权利要求1所述的一种环状长单链dna制备方法,其特征在于，s6中纯化具体步骤为：用骨架特异性限制内切酶及核酸外切酶除未亲本质粒及基因组dna获得高纯度minicircle dna。

7.根据权利要求1所述的一种环状长单链dna制备方法,其特征在于，pmc.cirdna载体的核苷酸序列如seq id no:1所示。

技术总结
本发明公开了一种环状长单链DNA制备方法，涉及核酸技术领域。本发明制备pMC.cirDNA载体，载体上包括attB元件、attP元件以及诱导型启动子；并在attB元件后添加Nt.BspQI识别位点，attP元件前添加Nb.BsrDI识别位点；将目的DNA克隆至pMC.cirDNA载体BspQI识别位点与BsrDI识别位点之间；诱导、转化、纯化得到环状长单链DNA。本发明利用此方法可在30日内制备100‑8000nt，2ug‑10mg的环状ssDNA。

技术研发人员：喻明军,崔康乐,王维坤,纪世春
受保护的技术使用者：通用生物（安徽）股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15