一种去甲基化酶辅助的RNA中N1-甲基腺嘌呤的特定位点定量分析方法和试剂盒

本发明属于生物，涉及一种去甲基化酶辅助的rna中n1-甲基腺嘌呤的特定位点定量分析方法和试剂盒。

背景技术：

1、自从60多年前第一种rna修饰被发现以来，已经在来自真核和原核等各物种的各种rna种类中确定了150多种化学修饰。rna修饰发生在核糖体rna(rrna)、转运rna(trna)、信使rna(mrna)和非编码rna(snrna)中。

2、n1-甲基腺嘌呤(m1a)被发现存在于所有生命体中，是一种发生在trna、rrna、mrna和线粒体rna中的可逆性化学修饰。原核生物中，m1a能够被烷基化修复同源物b(alkb)去甲基化，而真核生物中，m1a可以被alkb同源物1、alkb同源物3和脂肪量和肥胖相关蛋白从trna中擦除。m1a在生理条件下带有正电荷，在维持trna的三级结构稳定性和功能方面起着重要作用。在mrna中，m1a的甲基阻断了watson-crick碱基互补配对，从而影响trna的折叠，核糖体的成熟和翻译过程。

3、近年来，基于质谱和测序的技术已经被广泛应用于发现、识别和定位rna修饰。m1a中n1-甲基的存在可以在逆转录中引起逆转录终止或错误配对的特征，结合高通量测序，这种方法已被用来绘制m1a的转录组图谱。然而，这些基于高通量测序的方法通常需要复杂的样品预处理和测序库构建，这很耗时，成本高，而且需要复杂的生物信息学分析。基于质谱的分析一般只能提供整体水平的rna修饰进行鉴定和定量，不能获取rna修饰的位点信息。在一些研究中，需要评估某些关键位点的m1a的修饰水平。因此，需要一种能够快速、直接、定点检测和定量m1a的方法。

4、已有报道一种连接酶辅助的方法，用于检测rna中的单位点m1a的含量。然而，对于m1a的定量，这种方法需要对两个位点进行两次测量，即一个被检测的位点和一个没有m1a修饰的对照位点，这相对来说是很繁琐的。

5、因此，有必要开发一种方法操作简单，能够快速、经济地对rna中的m1a(n1-甲基腺嘌呤)进行定点检测和定量分析的方法。

技术实现思路

1、为了解决所述技术问题，本发明提供了一种去甲基化酶辅助的rna中n1-甲基腺嘌呤的特定位点定量分析方法和试剂盒，该方法操作简单，能够快速、经济地对rna中的m1a进行定点检测和定量分析。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、在本发明的第一方面，提供了一种去甲基化酶辅助的rna中n1-甲基腺嘌呤的特定位点定量分析方法和试剂盒，所述方法包括：

4、利用逆转录酶对rna样品进行第一逆转录反应，获得截短cdna样品；

5、采用alkb蛋白对rna样品进行去甲基化处理，后高温灭活处理以使alkb灭活而终止反应，获得去甲基化后的rna；后利用逆转录酶对所述去甲基化后的rna进行第二逆转录反应，获得全长cdna样品；

6、将所述全长cdna样品和所述截短cdna样品分别进行定量实时pcr反应，获得样品的ct值，根据ct值获得扩增片段内m1a位点的甲基化含量。

7、进一步地，所述逆转录酶包括protoscript ii逆转录酶、bst3.0、m-mulv和amv中的一种。

8、进一步地，所述第一逆转录反应条件为：单链rna在含tris-hcl 20～100mm、ph7.5～9.0、kcl 25～150mm、mgcl2 1-5mm、二硫苏糖醇2～20mm、dntp混合物0.2～2mm、重组rnase抑制剂0.2～2uμl-1、逆转录酶0.5～5uμl-1、特异性逆转录引物：rna样品＝1：1～10：1的反应体系中，35～50℃下反应0.5～4小时。

9、进一步地，所述rna样品进行去甲基化处理条件为：单链rna在含4-羟乙基哌嗪乙磺酸25～100mm、ph 7.0～8.5、α-酮戊二酸0.5～5mm、硫酸亚铁铵25～250mm、抗坏血酸1～10mm、alkb蛋白10～100μm的反应体系中，于30～45℃反应0.5～6小时。

10、进一步地，所述第二逆转录反应条件为：去甲基化后的rna在含tris-hcl 20～100mm、ph 7.5～9.0、kcl 25～150mm、mgcl2 1-5mm、二硫苏糖醇2～20mm、dntp混合物0.2～2mm、重组rnase抑制剂0.2～2uμl-1、逆转录酶0.5～5uμl-1、特异性逆转录引物：rna样品＝1：1～10：1的反应体系中，35～50℃下反应0.5～4小时。

11、在本发明的第二方面，提供了alkb去甲基化酶和逆转录酶的组合在对rna中特定位点的n1-甲基腺嘌呤进行定量分析中的应用。

12、在本发明的第三方面，提供了一种去甲基化酶辅助的rna中n1-甲基腺嘌呤的特定位点定量试剂盒，所述试剂盒包括：alkb去甲基化酶和逆转录酶。

13、进一步地，所述试剂盒还包括：

14、采用alkb进行去甲基化的反应组分：4-羟乙基哌嗪乙磺酸、ph 7.0～8.5、α-酮戊二酸、硫酸亚铁铵和抗坏血酸；

15、采用逆转录酶进行逆转录的反应组分：tris-hcl、ph 7.5～9.0、kcl、mgcl2、二硫苏糖醇、dntp混合物、重组rnase抑制剂和特异性逆转录引物。

16、本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

17、本发明提供的去甲基化酶辅助的rna中n1-甲基腺嘌呤的特定位点定量分析方法和试剂盒，m1a中的n1-甲基可以干扰m1a和胸腺嘧啶之间氢键的形成，而腺苷和胸腺嘧啶可以形成经典的watson-crick碱基配对。在本发明方法中，rna中的m1a将导致rt在m1a位点处停止，产生截短的cdna。用alkb去除m1a将恢复产生全长的cdna。通过qpcr评估产生的全长cdna的数量可以实现rna中m1a的特定位点定量分析(图1)。

18、该方法操作简便，无需复杂的样品前处理；经济、成本低，无需高通量测序；简单快速，只需进行去甲基化反应和rt-qpcr反应。本发明方法中涉及的alkb蛋白的去甲基化效率高(99.9％)，有利于m1a的准确定量。适用性广，能够用于细胞内各种rna中特定位点m1a的准确定量，为解读m1a在人类疾病中的功能提供了宝贵的工具。

技术特征：

1.一种去甲基化酶辅助的rna中n1-甲基腺嘌呤的特定位点定量分析方法，其特征在于，所述方法包括：

2.根据权利要求1中所述的一种去甲基化酶辅助的rna中n1-甲基腺嘌呤的特定位点定量分析方法，其特征在于，所述逆转录酶包括protoscript ii逆转录酶、bst3.0、m-mulv和amv中的一种。

3.根据权利要求1中所述的一种去甲基化酶辅助的rna中n1-甲基腺嘌呤的特定位点定量分析方法，其特征在于，所述第一逆转录反应条件为：单链rna在含tris-hcl 20～100mm、ph 7.5～9.0、kcl 25～150mm、mgcl2 1-5mm、二硫苏糖醇2～20mm、dntp混合物0.2～2mm、重组rnase抑制剂0.2～2uμl-1、逆转录酶0.5～5uμl-1、特异性逆转录引物：rna样品＝1：1～10：1的反应体系中，35～50℃下反应0.5～4小时。

4.根据权利要求1中所述的一种去甲基化酶辅助的rna中n1-甲基腺嘌呤的特定位点定量分析方法，其特征在于，所述rna样品进行去甲基化处理条件为：单链rna在含4-羟乙基哌嗪乙磺酸25～100mm、ph 7.0～8.5、α-酮戊二酸0.5～5mm、硫酸亚铁铵25～250mm、抗坏血酸1～10mm、alkb蛋白10～100μm的反应体系中，于30～45℃反应0.5～6小时。

5.根据权利要求1中所述的一种去甲基化酶辅助的rna中n1-甲基腺嘌呤的特定位点定量分析方法，其特征在于，所述第二逆转录反应条件为：去甲基化后的rna在含tris-hcl20～100mm、ph 7.5～9.0、kcl 25～150mm、mgcl2 1-5mm、二硫苏糖醇2～20mm、dntp混合物0.2～2mm、重组rnase抑制剂0.2～2uμl-1、逆转录酶0.5～5uμl-1、特异性逆转录引物：rna样品＝1：1～10：1的反应体系中，35～50℃下反应0.5～4小时。

6.根据权利要求1中所述的一种去甲基化酶辅助的rna中n1-甲基腺嘌呤的特定位点定量分析方法，其特征在于，所述根据ct值获得扩增片段内m1a位点的甲基化含量，包括：

7.alkb去甲基化酶和逆转录酶的组合在对rna中特定位点的n1-甲基腺嘌呤进行定量分析中的应用。

8.一种去甲基化酶辅助的rna中n1-甲基腺嘌呤的特定位点定量试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：alkb去甲基化酶和逆转录酶。

9.根据权利要求8中所述的一种去甲基化酶辅助的rna中n1-甲基腺嘌呤的特定位点定量试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：

技术总结
本发明提供了一种去甲基化酶辅助的RNA中N<supgt;1</supgt;‑甲基腺嘌呤的特定位点定量分析方法和试剂盒，所述方法包括：利用逆转录酶对RNA样品进行第一逆转录反应，获得截短cDNA样品；采用AlkB蛋白对RNA样品进行去甲基化处理，后高温灭活处理以使AlkB灭活而终止反应，获得去甲基化后的RNA；后利用逆转录酶对所述去甲基化后的RNA进行第二逆转录反应，获得全长cDNA样品；将所述全长cDNA样品和所述截短cDNA样品分别进行定量实时PCR反应，获得样品的Ct值，根据Ct值获得扩增片段内m<supgt;1</supgt;A位点的甲基化含量。该方法操作简单，能够快速、经济地对RNA中的m<supgt;1</supgt;A进行定点检测和定量分析。

技术研发人员：袁必锋,熊军,陈可可,冯钰锜
受保护的技术使用者：武汉大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15