一种非小细胞肺癌四代TKI-TQB3804耐药细胞系的建立方法

本发明属于生物医药。更具体地，涉及一种tqb3804耐药细胞株及其应用。

背景技术：

1、非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，nsclc)在所有肺癌患者中约占80-85％，表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，egfr)是nsclc最常见的突变驱动基因。针对egfr突变开发的酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors，tkis)在nsclc的靶向治疗中占据重要地位，由于获得性耐药无法避免，tkis的发展与迭代可以看作是nsclc靶向治疗的发展史。以吉非替尼、阿法替尼为代表的一代、二代egfr-tkis对常见egfr突变(19del，l858r)均具有良好的抑制效果，但是长期应用会产生t790m突变，比例约为50-60％。以奥希替尼(osimertinib，osi)为代表的三代tki，对19del/t790m、l858r/t790m突变表现出良好的治疗效果，已成为egfr突变阳性的局部晚期或转移性nsclc一线治疗的新标准。数据显示，t790m与c797s突变是osi的主要耐药机制，占比分别为44％与29％。因此，针对t790m与c797s突变是四代tki的主要靶点。

2、tqb3804是正大天晴药业研发的第四代tki。临床前研究显示，tqb3804对19del/t790m/c797s、l858r/t790m/c797s、d746-750/t790m及l858r/t790m的二重及三重突变均有较强的抑制能力，且在19del/t790m/c797s的不同动物模型中也能较好地延缓肿瘤的增长，即tqb3804对一/二/三代tki耐药后出现egfr三重及二重突变的肿瘤细胞均有不错的抑制能力。目前，tqb3804的i期临床研究(nct04128085)正在稳步进展中。随着tqb3804临床试验的逐级推进，推测多数osi耐药患者将会从tqb3804中获得新的os获益。然而tqb3804的获得性耐药也将紧随其后成为新的临床问题。面对尚未进入临床应用的四代tki，如若能在早期预判其耐药机制，将会为五代tki的开发提供潜在靶点，为tki的迭代缩短开发周期，为更多的耐药患者争取更长线的治疗。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明第一方面提供了一种tqb3804耐药细胞株，所述细胞株命名为h1975/osi-tqb，于2023年5月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc no：c2023146。

2、在某些实施方式中，所述细胞株为肺癌细胞株。

3、本发明第二方面提供了根据本发明第一方面所述的tqb3804耐药细胞株在肿瘤细胞耐药机理研究中的应用。

4、本发明第三方面提供了根据本发明第一方面所述tqb3804耐药细胞株在筛选逆转肿瘤耐药性的药物中的应用。

5、在某些实施方式中，所述肿瘤为肺癌。

6、在某些实施方式中，所述肺癌为非小细胞癌。

7、在某些实施方式中，所述肺癌为肺腺癌。

8、本发明第四方面提供了一种tqb3804耐药细胞株筛选方法，所述方法包括如下步骤：1)肺癌细胞系h1975/osi细胞培养；2)待细胞融合至一定程度时，进行tqb3804的初始诱导；优选地，初始诱导浓度为2nm；3)以4nm为梯度，使细胞逐步在6、10nm tqb3804中恢复正常生长与传代；4)以20nm或30nm为梯度，使细胞逐步在30、50、70、100nm tqb3804中恢复正常生长与传代；5)以200nm或300nm为梯度，使细胞逐步在300、500、700、1000nm tqb3804中恢复正常生长与传代；6)以2μm为梯度，使细胞逐步在3、5μm tqb3804中恢复正常生长与传代；7)筛选可在5μm的tqb3804中正常生长与增殖的细胞株；8)获得的耐药细胞冻存后再复苏，以1μm tqb3804为培养浓度，将细胞在该剂量下持续培养、传代，历经1个月的稳定期，获得具有稳定耐药性的四代tki耐药株。

9、本发明第五方面提供了根据本发明第四方面所述的筛选方法筛选获得的tqb3804耐药细胞株。

10、在某些实施方式中，所述细胞株如本发明第一方面所述。

11、本发明相对于现有技术的有益效果是：

12、本发明以三代tki耐药株(h1975/osi)为研究对象，采用逐步增加药物浓度法构建了耐受tqb3804的新型耐药株h1975/osi-tqb，为四代tki的耐药机制的研究提供了首个体外耐药细胞系模型，为相关靶点的开发打下了基础。

13、本发明构建的h1975/osi-tqb细胞的耐药指数为72.08，呈现出更细长、更小的细胞形态，同时增殖能力显著降低，而克隆形成能力与迁移能力均显著增强。

技术特征：

1.一种tqb3804耐药细胞株，其特征在于，所述细胞株命名为h1975/osi-tqb，于2023年5月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc no：c2023146。

2.根据权利要求1所述的tqb3804耐药细胞株，其特征在于，所述细胞株为肺癌细胞株。

3.根据权利要求1或3所述的tqb3804耐药细胞株在肿瘤细胞耐药机理研究中的应用。

4.根据权利要求1所述tqb3804耐药细胞株在筛选逆转肿瘤耐药性的药物中的应用。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为肺癌。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述肺癌为非小细胞癌。

7.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述肺癌为肺腺癌。

8.一种tqb3804耐药细胞株筛选方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：1)肺癌细胞系h1975/osi细胞培养；2)待细胞融合至一定程度时，进行tqb3804的初始诱导；优选地，初始诱导浓度为2nm；3)以4nm为梯度，使细胞逐步在6、10nm tqb3804中恢复正常生长与传代；4)以20nm或30nm为梯度，使细胞逐步在30、50、70、100nmtqb3804中恢复正常生长与传代；5)以200nm或300nm为梯度，使细胞逐步在300、500、700、1000nm tqb3804中恢复正常生长与传代；6)以2μm为梯度，使细胞逐步在3、5μmtqb3804中恢复正常生长与传代；7)筛选可在5μm的tqb3804中正常生长与增殖的细胞株；8)获得的耐药细胞冻存后再复苏，以1μmtqb3804为培养浓度，将细胞在该剂量下持续培养、传代，历经1个月的稳定期，获得具有稳定耐药性的四代tki耐药株。

9.根据权利要求8所述的筛选方法筛选获得的tqb3804耐药细胞株。

10.根据权利要求9所述的耐药细胞株，其特征在于，所述细胞株如权利要求1或2所述。

技术总结
本发明公开了一种TQB3804耐药细胞株，所述细胞株命名为H1975/OSI‑TQB，于2023年5月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2023146。H1975/OSI‑TQB细胞的耐药指数为72.08，呈现出更细长、更小的细胞形态，同时增殖能力显著降低，而克隆形成能力与迁移能力均显著增强。本发明公开的H1975/OSI‑TQB为四代TKI的耐药机制的研究提供了首个体外耐药细胞系模型，为相关靶点的开发打下了基础。

技术研发人员：宋琳,彭娟,王刚
受保护的技术使用者：上海交通大学医学院附属新华医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15