一种非病毒基因载体及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物医用材料，具体涉及一种非病毒基因载体及其制备方法和应用。

背景技术：

1、目前癌症的治疗主要有外科手术、放射疗法以及抗肿瘤药物，外科手术和放射疗法是用于治疗局部非转移性肿瘤的主要治疗手段，而抗肿瘤药物如化学疗法、激素和生物疗法优选用于治疗转移性肿瘤。但化学治疗药物可诱导正常细胞发生量破坏，并且具有毒性，因此迫切需要寻找另一种针对癌症的有效靶向治疗方法，即基因治疗。癌症基因治疗的成功不仅取决于良好的分子策略，该策略包括设计专门在肿瘤细胞内表达的特定遗传物质，还取决于安全，高效和可控的载体制备。

2、病毒载体是最先提出用于基因治疗的载体，病毒的性质和特性使它们成为将rna和dna传递到人细胞的载体，并进行了多项临床试验，批准了一些基因治疗药物。然而，免疫原性，限于遗传负荷，由于治疗有效载荷插入到控制细胞生长的基因附近而导致的癌症风险，以及病毒载体的量产是有限制的，促进了纳米医学支持的非病毒载体的开发和工程。

3、非病毒基因载体作为基因治疗载体，由于其易于合成和功能化，免疫原性和毒性较低，是生物医学研究中最有前途的技术之一，一个成功的非病毒传递系统必须有良好的循环时间，使载体以低毒性作用穿透靶组织，并具有载体系统的生物相容性和生物降解性。聚乙烯亚胺(polyethylenimine，pei)，其分子结构是稳定的，使它们能够作为进一步修饰的支架，以改善其在体内应用的性能，被认为是最有效的药物载体之一。但是，pei具有很大的细胞毒性，而且其细胞毒性具有分子量依赖性，故而需求一种生物相容性较好的阳离子聚合物作为基因递送载体十分有必要。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的问题和不足，本发明的目的旨在提供一种非病毒基因载体及其制备方法和应用。

2、本发明第一方面提供了一种非病毒基因载体，所述非病毒基因载体的结构式如下：

3、

4、其中，n表示聚合物重复单元的个数。

5、根据上述的非病毒基因载体，优选地，所述非病毒基因载体是由黄芩苷、聚乙烯亚胺通过交联反应制备而成。更加优选地，所述非病毒基因载体是由黄芩苷、聚乙烯亚胺通过edc/nhs交联反应制备而成。

6、根据上述的非病毒基因载体，优选地，所述聚乙烯亚胺的分子量为25000。

7、根据上述的非病毒基因载体，优选地，所述n的取值为59～61。

8、本发明第二方面提供了一种上述第一方面所述非病毒基因载体的制备方法，具体为：向黄芩苷溶液中加入edc和nhs，混合均匀，再加入聚乙烯亚胺，搅拌反应，反应结束后将反应产物进行透析，去除未发生反应的pei、eds和nhs，将透析后的反应产物冻干，即得所述非病毒基因载体。

9、根据上述的制备方法，优选地，所述黄芩苷熔液的制备方法为：将黄芩苷加入mes缓冲液中，调节mes缓冲液的ph为6-7，搅拌溶解，得到黄芩苷溶液。更加优选的，采用1mol/l的naoh溶液调节mes缓冲液的ph。

10、根据上述的制备方法，优选地，所述黄芩苷与edc、nhs的摩尔比为1:1-10:1.2-12。

11、根据上述的制备方法，优选地，所述黄芩苷中氨基的摩尔量与聚乙烯亚胺中氨基的摩尔之比1:1。

12、根据上述的制备方法，优选地，所述透析截留分子量为3500-12000。

13、本发明第三方面提供了上述第一方面所述非病毒基因载体在基因递送中的应用，即所述非病毒基因载体作为基因递送载体，负载目的基因。

14、本发明第四方面提供了上述第一方面所述非病毒基因载体在制备用于基因治疗的药物中的应用。

15、本发明第五方面提供了一种纳米复合物，所述纳米复合物由上述第一方面所述非病毒基因载体和核酸组成。

16、根据上述的纳米复合物，优选地，所述核酸为dna、sirna或mirna。

17、根据上述的纳米复合物，优选地，所述核酸为mir-34a。所述纳米复合物中所述非病毒基因载体与mir-34a的质量比为10:1。

18、本发明第六方面提供了上述第五方面提供了纳米复合物的制备方法，所述制备方法包括：将上述第一方面所述非病毒基因载体和核酸分别加入基础培养基中孵育4-8分钟，然后将非病毒基因载体-基础培养基混合液与核酸-基础培养基混合液混合孵育15-25分钟，即得纳米复合物。

19、本发明第七方面提供了上述第五方面提供了纳米复合物在基因递送中的应用(即所述非病毒基因载体作为基因递送载体，负载目的基因)或制备用于基因治疗的药物中的应用。进一步地，所述药物为肺癌治疗药物。

20、本发明第八方面提供了一种基因递送系统。所述基因递送系统包括载体和负载在所述载体上的治疗基因，所述载体为上述第一方面所述非病毒基因载体。

21、与现有技术相比，本发明取得积极有益效果如下：

22、(1)本发明的非病毒基因载体为由黄芩苷和pei通过edc/nhs交联反应合成的ba-pei聚合物，ba-pei聚合物中多胺分子仍然保持着仲胺和叔胺，因此能够与靶基因通过电荷连接形成稳定且可溶的复合物，有效地将靶基因传递到细胞内，然后很好地释放。与pei25k相比，本发明ba-pei聚合物生物相融性好，细胞毒性低，转染效率高，在基因投递领域具有广阔的应用前景。

23、(2)本发明非病毒基因载体ba-pei能够有效介导mir-34a递送到肺癌细胞或/和肺肿瘤模型动物中，并显著抑制肺肿瘤；而且，黄芩苷具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗癌等功能，非病毒基因载体ba-pei中的黄芩苷与mir-34a协同，共同发挥抗肿瘤作用，极大地增强了抗肿瘤治疗疗效。

24、(3)本发明非病毒基因载体制备方法简单，操作方便、原料成本低，且无有机溶剂残留，环保无污染。

技术特征：

1.一种非病毒基因载体，其结构式如下：

2.根据权利要求1所述的非病毒基因载体，其特征在于，所述非病毒基因载体是由黄芩苷、聚乙烯亚胺通过交联反应制备而成。

3.权利要求1或2所述非病毒基因载体的制备方法，其特征在于，向黄芩苷溶液中加入edc和nhs，混合均匀，再加入聚乙烯亚胺，搅拌反应，反应结束后将反应产物进行透析，去除未发生反应的pei、eds和nhs，将透析后的反应产物冻干，即得所述非病毒基因载体。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述黄芩苷与edc、nhs的摩尔比为1:1-10:1.2-12；所述黄芩苷中氨基的摩尔量与聚乙烯亚胺中氨基的摩尔之比1:1。

5.权利要求1或2所述非病毒基因载体在基因递送中的应用或在制备用于基因治疗的药物中的应用。

6.一种纳米复合物，所述纳米复合物由权利要求1或2所述非病毒基因载体和核酸组成。

7.根据权利要求6所述的纳米复合物，其特征在于，所述核酸为dna、sirna或mirna。

8.根据权利要求7所述的纳米复合物，其特征在于，所述核酸为mir-34a。

9.权利要求6-8任一所述纳米复合物在基因递送或制备用于基因治疗的药物中的应用。

10.一种基因递送系统，包括载体和负载在所述载体上的治疗基因，所述载体为权利要求1或2所述非病毒基因载体。

技术总结
本发明涉及生物医用材料技术领域，具体涉及一种非病毒基因载体及其制备方法和应用。本发明提供的非病毒基因载体是由黄芩苷、聚乙烯亚胺通过EDC/NHS交联反应制备而成，该非病毒基因载体能够用于基因递送，还能够用于制备基因治疗的药物。本发明还提供了一种纳米复合物，纳米复合物由所述非病毒基因载体和核酸组成，该纳米复合物不仅能够用于基因递送，还能够用于制备基因治疗的药物。本发明的纳米复合物不仅能将靶基因有效地送到细胞内，同时miR‑34a与黄芩苷协同，共同发挥抗肿瘤作用，极大地增强了抗肿瘤治疗疗效。

技术研发人员：邢珺月,王莹莹,姜伟,刘影,唐颢
受保护的技术使用者：邢珺月
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15