基因特异性空间滚环扩增和NGS测序的制作方法

本发明涉及一种获得组织样品上至少一条m-rna链的目标序列的空间位置和序列信息的方法。

背景技术：

1、在亚细胞水平上检测组织上所有表达的基因并同时获得这些基因的序列和/或空间信息是具有挑战性的。

2、本发明描述了一种如下的方法：使用含有独特分子标识符(umi)探针的定位环(或随后进行连接的开环)识别和扩增信使rna上的特定区域，随后逆转录含有突变或序列变体的感兴趣区域并复制umi的序列信息。所得的具有umi信息的cdna通过在组织切片上产生的滚环扩增(rca)产物的ngs进行回收、提取和测序。

3、wo2020076976公开了一种通过fisseq获得包括空间位置在内的核酸的序列信息的方法。wo2019199579教导了一种用于类似目的的蜗牛探针系统。

技术实现思路

1、因此，本发明的目的是提供一种方法，其以比已知技术更高的分辨率同时获得目标序列的空间位置和序列信息。

2、这里我们描述了一种方法，用于：

3、(1)通过使用具有umi的杂交环状/线性dna探针对组织上表达的mrna进行空间定位。

4、(2)用逆转录酶复制具有umi的环状/线性dna探针退火的区域下游的相邻区域的核苷酸信息。同时，携带umi序列的杂交探针的环状部分可以通过phusion dna聚合酶得以复制，并且将所得的复制的rna链与逆转录的cdna连接。

5、(3)然后从组织中提取含有umi的cdna链。

6、(4)然后用具有已知适配末端的pcr引物对所提取的含有umi的cdna链进行pcr扩增。

7、(5)将pcr产物环化并进行rca扩增。

8、(6)rca产物可以通过ngs进行测序。

9、本发明的目的是获得组织样品上至少一条m-rna链的目标序列的空间位置和序列信息的方法，该方法包括以下步骤：

10、a、提供定位探针，所述定位探针包括：a)通过能够结合环状定位器的定位器锚定区与环状定位器杂交的线性定位器，和b)能够与至少一条m-rna链结合的rna锚定区，和c)引物序列；并且其中，所述环状定位器包含umi区域、第一和第二引物区域以及与所述线性定位器的定位器锚定区互补的区域；

11、b、将带有所述rna锚定区的所述定位探针与所述m-rna链杂交；

12、c、使用m-rna链作为模板互补所述定位探针的rna锚定区，从而获得逆转录的c-dna链；

13、d、使用所述环状定位器作为模板从所述第一引物区域开始互补所述环状定位器，并将所得的低聚物与所述线性定位器的定位器锚定区连接，从而获得包含所述umi区域和所述m-rna链的目标序列的扩展的逆转录c-dna链；

14、e、从组织样品上的第二引物区域开始将环状定位器通过rca进行倍增，产生至少一个第一圆形克隆(rolony)(仅一个l)；

15、f、对所述至少一个第一圆形克隆进行空间分辨测序，从而获得所述至少一个第一圆形克隆的空间和序列信息(或者换句话说：通过对至少一个第一圆形克隆进行测序来获得空间坐标和环状定位器umi)；

16、g、从组织中去除扩展的逆转录c-dna链，并将所述扩展的逆转录c-dna链与m-rna链去杂交，获得单链低聚物；

17、h、在3'端和5'端为所述单链低聚物提供第一和第二适配引物，获得经引物处理的单链低聚物，通过pcr扩增所述经引物处理的单链低聚物，并且通过将所述第一和第二适配引物彼此连接而使所述经引物处理的单链低聚物环化，从而产生环状的单链低聚物；

18、i、将所述环状的单链低聚物通过rca倍增成第二圆形克隆；对第二圆形克隆进行测序，并通过umi序列将第一圆形克隆的空间信息与第二圆形克隆的序列信息关联起来。

19、本发明涉及一种使用杂交探针在给定组织中对感兴趣基因进行空间定位的方法，所述杂交探针含有环状(图1a)或开环分子(图1b)，具有随机且非预定义的独特分子标识符(umi)和两个启动区域。所述环/开环可以预先附着到线性dna引物上(图1a和图1b)，或者在线性引物直接附着到组织上mrna上所需区域上游的序列后，环状定位器可以与线性dna引物杂交(图1c)。然后，可以通过使用寡核苷酸引物直接在组织上进行滚环扩增(rca)来扩增杂交探针的环状部分，从而在给定组织上表达mrna的确切位置处产生rca产物。然后，可以通过对rca产物进行测序来对随机且非预定义的umi进行解码。

20、接下来，通过使用相同的杂交探针作为引物对mrna进行逆转录，可以同时捕获在组织上被空间定位的同一mrna上含有核苷酸变化或变体的特定感兴趣区域的所需序列信息。

21、在逆转录的同时，可以通过phusion dna聚合酶在同一逆转录cdna链上捕获umi信息，该phusion dna聚合酶由专门设计来复制环状链的dna引物启动。一旦phusion dna聚合酶复制了dna环，就可以将其连接到捕获感兴趣区域中序列信息的同一cdna链上。如果使用开环定位探针，则在此时将其连接以形成闭环。

22、然后从组织中物理地回收并提取连接了umi的cdna。

23、然后使用pcr引物对回收的cdna进行pcr扩增，所述引物在所述cdna的5'端和3'端退火并携带dna适配体。

24、然后可以使用夹板桥寡核苷酸引物将pcr扩增的产物环化，所述引物使产物两端连接在一起。

25、然后通过滚环扩增(rca)对所述环进行扩增。然后对rca产物进行测序。

26、通过ngs测序，感兴趣的空间标识符umi和相关联的mrna序列可以被分配组织位置。

27、通过ngs测序，可以分析基因组dna或mrna上的感兴趣的目标区域、突变或核苷酸变体。

技术特征：

1.一种获得组织样品上至少一条m-rna链的目标序列的空间位置和序列信息的方法，所述方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤a)中提供的所述环状定位器为闭环。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤a)中提供的所述环状定位器为开环，并且其中，在倍增所述环状定位器之前在步骤d)中使开环的3'和5'端彼此连接，从而产生环状定位器。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，用t4 dna连接酶将所述开环的3'端和5'端彼此连接，其中，所述环状定位器的第二引物区域用作桥夹板。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，通过phusion dna聚合酶，使用所述环状定位器的第一引物区域作为起始引物，进行步骤d)中的所述环状定位器的互补。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，通过dna连接酶进行步骤d)中的连接步骤。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，通过首先将所述线性定位器与所述环状定位器杂交来提供所述定位探针。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，通过首先将所述线性定位器与所述至少一条m-rna链杂交，然后将所述环状定位器与所述线性定位器杂交来提供所述定位探针。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，通过首先将所述线性定位器与所述至少一条m-rna链杂交，将所述定位探针的rna锚定区互补入逆转录的c-dna链，然后将所述环状定位器与所述线性定位器杂交来提供所述定位探针。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于，在3'端和5'端添加第一适配引物和第二适配引物之前，将所述单链低聚物物理地剪切成更小的片段。

技术总结
本发明涉及一种以比已知技术更高的分辨率同时获得目标序列的空间位置和序列信息的方法。该方法包括通过使用具有UMI的杂交的环状/线性DNA探针对组织上表达的mRNA进行空间定位的步骤，以及在几个扩增步骤后，通过NGS获得序列信息的步骤。

技术研发人员：R·皮纳德,S·霍索诺
受保护的技术使用者：美天施生物科技有限两合公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15