一种基于催化发夹自组装等温扩增技术结合免疫磁珠捕获快速检测大肠杆菌O157:H7的方法

本发明属于食品安全，具体涉及一种快速检测大肠杆菌o157:h7的方法。

背景技术：

1、大肠杆菌o157:h7(escherichia coli o157:h7)隶属于肠杆菌科埃希氏菌属，革兰氏染色阴性，无芽孢，有鞭毛，动力试验呈阳性，是一种肠道致病菌。大肠杆菌o157:h7主要传播途径为动物来源的食品，以乳及乳制品居多，感染后会引发出血性结肠炎、溶血性尿毒症综合征或血栓性血小板减少性紫癜等疾病，住院率和死亡率均高于包括沙门氏菌或弯曲杆菌在内的任何其他的肠道致病菌。无论成人还是儿童，大肠杆菌o157:h7感染都会对其健康造成严重威胁。因此，建立一种快速有效的大肠杆菌o157:h7的检测方法具有重大意义。

2、现阶段已开发出的用于检测大肠杆菌o157:h7的方法均具有一定局限性。传统的微生物学检测技术时效性差、在定量检测方面尚有欠缺，灵敏度和特异性易受到其它物质干扰；分子生物学技术对仪器和操作人员要求高，反应过程易受到污染，造成假阳性结果；仪器分析技术检测成本高昂，依赖专业人员；现有已开发出的一些核酸适体生物传感器技术所涉及的方法需要较长的预增菌时间，对乳中大肠杆菌o157:h7检测的灵敏度仍有待提高，这也是现阶段食源性致病菌快速检测领域发展所遇到的最大瓶颈之一。因此开发一种灵敏度高、特异性好、操作简便，成本较低的大肠杆菌o157:h7快速检测方法成为了目前研究的重中之重。

技术实现思路

1、本发明提供了一种基于催化发夹自组装等温扩增技术结合免疫磁珠捕获快速检测大肠杆菌o157:h7的方法，解决了检测大肠杆菌o157:h7技术时效性差、灵敏度低、特异性差、操作复杂以及成本较高的问题。

2、本发明采用的技术方案如下：

3、一种基于催化发夹自组装等温扩增技术结合免疫磁珠捕获快速检测大肠杆菌o157:h7的方法，所述方法包括如下步骤：

4、(1)将5’端标记生物素的大肠杆菌适配体aptamer和与其互补短链cdna混合，形成复合物aptamer-cdna；所述大肠杆菌适配体aptamer的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述互补短链cdna的核苷酸序列如seq id no.2所示；

5、(2)将链霉亲和素磁珠smbs与步骤(1)中获得的aptamer-cdna偶联形成smbs-aptamer-cdna磁珠复合物；

6、(3)将smbs-aptamer-cdna磁珠复合物磁分离后移去上清液，向磁分离后的smbs-aptamer-cdna磁珠复合物中加入大肠杆菌o157:h7菌液进行孵育，孵育完成后进行磁分离取上清液；

7、(4)向步骤(3)中获得的上清液中加入发夹探针hp1、hp2、hp3进行等温扩增反应得到获得含有g-四链体结构的溶液，所述hp1的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述hp2的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述hp3的核苷酸序列如seq id no.5所示；

8、(5)向步骤(4)获得的含有g-四链体结构的溶液中加入hemindna酶孵育后，加入h2o2和tmb溶液反应，反应后溶液结果成蓝色，用多功能酶标仪测定吸光值，完成检测。

9、进一步的，所述步骤(1)中，将5’端标记生物素的大肠杆菌适配体aptamer和与其互补短链cdna混合，形成复合物aptamer-cdna的方法为：将等体积的3μm 5’端标记生物素的大肠杆菌适配体aptamer和3μm适配体互补链cdna混合并在95℃加热5min，加热完成后置于室温下退火冷却，形成复合物aptamer-cdna。

10、进一步的，所述步骤(2)的具体过程为：将1mg的链霉亲和素磁珠smbs用1×b&w缓冲液洗涤3次，洗涤完成后用200ul 2×b&w缓冲液重悬，向重悬后的smbs中加入等体积的步骤(1)获得的aptamer-cdna进行孵育，获得smbs-aptamer-cdna磁珠复合物。

11、进一步的，所述向重悬后的smbs中加入等体积的步骤(1)获得的aptamer cdna进行孵育，孵育条件为温度37℃、摇床转速200rpm振荡孵育1h。

12、进一步的，所述步骤(3)中孵育条件为温度37℃、摇床转速180rpm孵育75min。

13、进一步的，所述步骤(4)中等温扩增反应条件为温度25℃，时间90min。

14、进一步的，所述步骤(5)中孵育条件为室温孵育，时间25min，形成g-四链体/hemindna酶，再加入h2o2和tmb溶液反应时间为12min。

15、进一步的，所述步骤(5)中多功能酶标仪测定吸光值的波长为650nm。

16、有益技术效果

17、本发明将催化发夹自组装技术与免疫磁分离方法结合，可以对乳中的大肠杆菌o157:h7实现快速、高特异性以及高灵敏度的检测。首先，利用磁分离技术，通过链霉亲和素包裹的磁珠与生物素标记的大肠杆菌o157:h7适配体结合，可以实现对纯培养以及液态乳中大肠杆菌o157:h7的捕获和富集。之后基于催化发夹自组装等温技术对磁分离后的目标片段进行不断循环扩增，特异性强，且能够显著提高比色核酸适配体传感器检测的灵敏度。

18、催化发夹自组装技术与免疫磁分离方法相结合时，免疫磁分离方法可以有效克服乳中的复杂基质(乳清、脂肪)对致病菌检测造成的干扰，并且对大肠杆菌o157:h7的捕获过程仅需75min，无需像传统检测法那样对大肠杆菌o157:h7进行预增菌(通常需要3-6小时)，可以大大缩短检测时间，使得该方法具有良好的时效性。其次，催化发夹自组装技术具有较高的信号放大效率、较低的背景信号和操作简单等优点，通过将微量目标片段不断扩增，达到显著提高检测结果灵敏度的目的。在此技术中，针对纯培养物中大肠杆菌o157:h7的检测限达到101cfu/ml，对于人工污染乳中大肠杆菌o157:h7的检测限可达到102cfu/ml，具有极高的灵敏度和特异性。

19、本发明将催化发夹自组装技术与免疫磁分离方法相结合，不仅可以实现对乳中大肠杆菌o157:h7的检测，还可以推广应用到液态乳中其他食源性致病菌例如沙门氏菌、克罗诺杆菌、单增李斯特氏菌等的检测，为液态乳中致病菌的检测提供了一种新的方式。

技术特征：

1.一种基于催化发夹自组装等温扩增技术结合免疫磁珠捕获快速检测大肠杆菌o157:h7的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，将5’端标记生物素的大肠杆菌适配体aptamer和与其互补短链cdna混合，形成复合物aptamer cdna的方法为：将等体积的3μm 5’端标记生物素的大肠杆菌适配体aptamer和3μm适配体互补链cdna混合并在95℃加热5min，加热完成后置于室温下退火冷却，形成复合物aptamer-cdna。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)的具体过程为：将1mg的链霉亲和素磁珠smbs用1×b&w缓冲液洗涤3次，洗涤完成后用200ul 2×b&w缓冲液重悬，向重悬后的smbs中加入等体积的步骤(1)获得的aptamer cdna进行孵育，获得smbs-aptamer-cdna磁珠复合物。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述孵育条件为温度37℃、摇床转速200rpm振荡孵育1h。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中孵育条件为温度37℃、摇床转速180rpm孵育75min。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中等温扩增反应条件为温度25℃，时间90min。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中孵育条件为室温孵育，时间25min，形成g-四链体/hemin dna酶，再加入h2o2和tmb溶液反应时间为12min。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中多功能酶标仪测定吸光值的波长为650nm。

技术总结
本发明公开了一种基于催化发夹自组装等温扩增技术结合免疫磁珠捕获快速检测大肠杆菌O157:H7的方法，属于食品安全技术领域。本发明为解决目前检测大肠杆菌O157:H7技术时效性差、灵敏度低、特异性差、操作复杂以及成本较高的问题。所述快速检测大肠杆菌O157:H7的方法是利用链霉亲和素磁珠‑大肠杆菌O157:H7适配体‑适配体互补链特异性捕获大肠杆菌O157:H7，再利用催化发夹自组装等温扩增技术实现对G‑四链体信号的放大，利用G‑四链体与氯化血红素结合后所具有的过氧化物酶活性，催化过氧化氢氧化3,3',5,5'‑四甲基联苯胺使溶液显色，并根据颜色信号的强弱实现对液态乳中大肠杆菌O157:H7数量的测定。本发明提供的方法操作简便、特异性强、灵敏度高，为食品中大肠杆菌O157:H7的检测提供参考。

技术研发人员：姜毓君,苏群超,杨鑫焱,满朝新,庞立冬
受保护的技术使用者：东北农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15