一种控制烟草叶柄形成发育的基因及其克隆方法和应用

本发明属于生物，具体为一种控制烟草叶柄形成发育的基因及其克隆方法和应用。

背景技术：

1、环境与遗传因素共同决定了叶柄的发育。光照和温度等环境因素影响叶柄的发育(tsukaya et al.,2002)。在许多植物中，光敏色素控制这叶柄的伸长(morgan and smith1979,child et al.1981,duke and lane 1984)。在长日照条加下，大豆叶柄长度较短日条件下变的更长(thomas et al.,1985)。叶柄有无的遗传往往被认为是由显性单基因控制(陈果等，2017；刘洪泰等，2019；李肯，2019)。在烟草中，陈果等(2017)利用ems诱导短叶柄突变体与无叶柄烟草种质革新三号杂交，构建f1、f2及bc1f1群体，确定叶柄突变体性状由一对单基因控制，进而利用ssr标记和bc1f1群体，将控制有无叶柄的基因定位在第16号连锁群标记pt51801和pt20196之间，该基因与两个标记的遗传距离分别为6.42厘摩和4.26厘摩。刘洪泰等(2019)利用有叶柄的枯斑三生和无叶柄的k326配置杂交组合，构建f1、f2、bc1f1及bc2f2群体，遗传分析表明有无叶柄受一对显性单基因控制。进而利用烟草430k snp芯片对bc2f1群体进行基因型分析，将相关基因定位在烟草第5号连锁群上，与标记m5-83共分离。

2、综上所述，关于烟草叶柄有无的遗传研究，仅仅局限于经典的遗传分析和初步定位上，控制叶柄有无的基因还未被克隆，因此本发明提出一种控制烟草叶柄形成发育的基因及其克隆方法和应用克服现有技术的不足和填补其研究领域的空白。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种控制烟草叶柄形成发育的基因及其克隆方法和应用，具有用于控制烟草叶柄发育和提高烟草生长质量和产量的优点。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种控制烟草叶柄形成发育的基因及其克隆方法和应用。

3、优选的，所述控制烟草叶柄形成发育的基因包括ntabknox1基因，所述ntabknox1基因其核苷酸序列如序列表中seq id no:1所示，其核苷酸的cds序列如序列表中seq idno:2所示。

4、优选的，所述ntabknox1基因的亲本选自烤烟品种k326和香料烟种质samsun。

5、优选的，所述ntabknox1基因包含突变体samsun-cas9-30或samsun-cas9-34，所述samsun-cas9-30的核苷酸序列如序列表中seq id no:3所示，所述samsun-cas9-34的核苷酸序列如序列表中seq id no:4所示。

6、优选的，所述突变体samsun-cas9-30在ntabknox1基因的第一个外显子上有一个t碱基插入；

7、所述突变体samsun-cas9-34在ntabknox1基因的第一个外显子上有一个a碱基插入。

8、优选的，所述ntabknox1基因不包含突变体samsun-cas9-30和/或samsun-cas9-34。

9、优选的，所述ntabknox1基因用于控制植物叶片的形态形成和发育。

10、优选的，所述ntabknox1基因用于控制烟草叶柄的形成和发育。

11、优选的，s1.大田环境下调查从烟草bc4f2单株个体中对有无叶柄的单株个体进行取样，利用pcr产物测序技术对单株个体基因型检测，进一步定位目标基因区间；

12、s2.通过已公布的烟草k326参考基因组比对和基因组注释分析，确定目标基因区间内与生长发育相关的基因，确定其为候选基因并命名为ntabknox1基；

13、s3.利用crispr/cas9技术构建基因编辑突变体，根据ntabknox1基因的cds序列设计两个编辑靶位点sg1和sg2，靶位点引物序列分别为sg1：gtttatggaagaagcagcgg；sg2：gggcgaggctatcggcagta，编辑载体采用bgk012-dsg载体；

14、s3.1.选取ntabknox1基因的cds序列的两个靶位点sg1和sg2两个靶位点，分别设计oligo(5’-3’)up/lw引物；

15、s3.2.制备oligo二聚体并通过t4连接酶与线型转化载体即grna-u6连接，反应体系为：配置grna-u6片段，1μl；t4 ligase，0.3μl；oligo二聚体，0.3μl；t4 pnk，0.1μl混匀后瞬时离心，在23℃条件下反应1h，继续加入t4 ligase，0.3μl；h2o，4μl；bgk012-dsg载体，1μl后23℃条件下反应1h或者4℃条件下过夜得到反应液；

16、s3.3.取上述反应液转化到dh5α感受态细胞中，冰浴静置30min后取出，42℃热激30s，立即置于冰上2min；加入lb液体培养基，振荡培养；取菌液涂布于lb固体培养基(lb+50mg/lkan)上，倒置培养，过夜；

17、s3.4.挑取单克隆接种到lb液体培养基(lb+50mg/lkan)中，扩大培养至浑浊，采用质粒提取试剂盒进行抽提；

18、s3.5.将测序成功的质粒转化eha105感受态细胞中，保存菌种。

19、与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

20、本发明不仅精确定位了基因区间位置，还控制烟草叶柄生长发育的基因进行克隆，分析了ntabknox1基因生物信息学，并对其功能进行了证明，该型基因可以广泛用于控制烟草叶柄的生长，构型和发育，可以用于提高叶片的机械支持和营养输送的效率，对烟草的生长质量和产量带来的显著的正面影响，对提高该种经济作物所带来的经济效益具有明显的现实意义。

技术特征：

1.一种控制烟草叶柄形成发育的基因，其特征在于：所述控制烟草叶柄形成发育的基因包括ntabknox1基因，所述ntabknox1基因其核苷酸序列如序列表中seq id no:1所示，其核苷酸的cds序列如序列表中seq id no:2所示。

2.根据权利要求1所述的一种控制烟草叶柄形成发育的基因，其特征在于：所述ntabknox1基因的亲本选自烤烟品种k326和香料烟种质samsun。

3.根据权利要求2所述的一种控制烟草叶柄形成发育的基因，其特征在于：所述ntabknox1基因包含突变体samsun-cas9-30或samsun-cas9-34，所述samsun-cas9-30的核苷酸序列如序列表中seq id no:3所示，所述samsun-cas9-34的核苷酸序列如序列表中seqid no:4所示。

4.根据权利要求3所述的一种控制烟草叶柄形成发育的基因，其特征在于：所述突变体samsun-cas9-30在ntabknox1基因的第一个外显子上有一个t碱基插入；

5.根据权利要求2所述的一种控制烟草叶柄形成发育的基因，其特征在于：所述ntabknox1基因不包含突变体samsun-cas9-30和/或samsun-cas9-34。

6.根据权利要求1-5所述的一种控制烟草叶柄形成发育的基因的应用，其特征在于：所述ntabknox1基因用于控制植物叶片的形态形成和发育。

7.根据权利要求6所述的一种控制烟草叶柄形成发育的基因的应用，其特征在于：所述ntabknox1基因用于控制烟草叶柄的形成和发育。

8.一种控制烟草叶柄形成发育的基因的克隆方法，其特征在于：

技术总结
本发明公开了一种控制烟草叶柄形成发育的基因及其克隆方法和应用，所述控制烟草叶柄形成发育的基因包括NtabKNOX1基因，所述NtabKNOX1基因的亲本选自烤烟品种K326和香料烟种质Samsun，所述NtabKNOX1基因包含突变体Samsun‑cas9‑30或Samsun‑cas9‑34，所述突变体Samsun‑cas9‑30在NtabKNOX1基因的第一个外显子上有一个T碱基插入，所述突变体Samsun‑cas9‑34在NtabKNOX1基因的第一个外显子上有一个A碱基插入。本发明不仅精确定位了基因区间位置，还控制烟草叶柄生长发育的基因进行克隆，分析了NtabKNOX1基因生物信息学，并对其功能进行了证明，该型基因可以广泛用于控制烟草叶柄的生长，构型和发育，可以用于提高叶片的机械支持和营养输送的效率，对烟草的生长质量和产量带来的显著的正面影响，对提高该种经济作物所带来的经济效益具有明显的现实意义。

技术研发人员：杨爱国,程立锐,付春祥,刘文文,刘昱彤,孙滢,刘洪泰,蒋彩虹
受保护的技术使用者：中国农业科学院烟草研究所（中国烟草总公司青州烟草研究所）
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15