一种5’端带3磷酸的oligoRNA的制备方法与流程

本申请涉及生物，更具体地说，涉及一种5’端带3磷酸的oligo rna的制备方法。

背景技术：

1、oligo rna是指人工设计的短片段rna，通常由十几到几十个核糖核苷酸组成，经常作为引物或探针，应用于测序、dna微阵列、fish等技术，在生物学研究和生物医药领域发挥着重要角色。

2、oligo rna的体外合成通常采用磷酸三酯法或亚磷酸三酯法，其基本原理是将要合成的寡核苷酸链的3’末端核苷先固定在一个不溶性的高分子上面，然后再从此末端核苷开始，逐步接长，每接长一个经历一次循环，最后将寡核苷酸链从固相载体上切落下来并脱去保护基，经过分离纯化得到所需的产物。由于核苷酸是一个多官能团的化合物，在化学合成rna中，必须将不希望发生反应的基团保护起来，因此核糖核苷酸5’位连接的始终是保护基团而非3磷酸基团，因此导致最终产物脱去保护基团后5’端不含有3磷酸基团，也就是说，现有技术中采用化学合成的方式还无法合成5’端带3磷酸的oligo rna。同时，传统ivt体外转录实验室以超螺旋质粒为酶切线性化之后为模板，转录得到大片段的rna，该模板需要质粒发酵制备，线性化等步骤，过程繁琐成本高。

技术实现思路

1、为了高效合成oligo rna，本申请提供一种5’端带3磷酸的oligo制备方法。

2、本申请提供一种5’端带3磷酸的oligo rna的制备方法，采用如下技术方案:

3、s1、采用β-乙腈亚磷酰胺合成带有t7启动子的oligo dna双链片段；

4、s2、以带有t7启动子的oligo dna双链片段为模板，体外转录合成oligo rna。

5、上述技术方案通过设计合成短序列的模板用于ivt转录实验，直接转录得到带5’端带3磷酸的oligo rna，可节省大量的原料成本，缩减过程，简便、高效。

6、优选的，所述oligo dna双链片段序列为如seq id no:2所示的序列，或为与seqid no:2所示的序列具有80％、90％、95％或98％同源性的序列。

7、seq id no:2

8、atcgaaattaatacgactcactataaggtcttctggtccccacagactca

9、优选的，所述oligo rna序列为如seq id no:1所示的序列，或为与seq id no:1所示的序列具有80％、90％、95％或98％同源性的序列。

10、seq id no:1

11、ppp-uccagaagaccaggggugucugagu

12、优选的，所述步骤s2中加入t7 rna聚合酶、无机焦磷酸酶、rnase抑制剂和ntp，进行体外转录，合成oligo rna。

13、优选的，加入dnaseⅰ消化去除模板dna，用rna磁珠进行回收。

14、优选的，所述步骤s2合成oligo rna后对产物进行纯化，分离出单一长度的oligorna产物。

15、优选的，通过hplc对产物进行纯化。

16、进一步优选的，所述进行纯化的色谱柱采用danpactmrp，4.6*50mm，4m。

17、进一步优选的，所述进行纯化流动相a：100mm teaa in water；流动相b：100mmteaa-75％water/15％甲醇/10％乙醇(v/v/v)。

18、进一步优选的，所述进行纯化柱温：80℃；流速：0.4ml/min。

19、优选的，纯化后验证产物的均一性和纯度。

20、优选的，通过hplc-ms验证产物的均一性和纯度。

21、进一步优选的，所述hplc采用acquity oligonucleaotide behc18colume 2.1*100mm,1.7μm。

22、进一步优选的，所述hplc流动相a：8mm tea-200mm hfip-water；流动相b：甲醇。

23、进一步优选的，所述hplc柱温：50℃；流速：0.3ml/min。

24、综上所述，本申请具有以下有益效果：

25、本申请首创了获得5’端带3磷酸的oligo rna的方法，是一种新型oligo rna的合成方法，操作快捷简便，成本低，产量大，纯度高，对rna序列、长度等无特殊要求，适用范围广。

技术特征：

1.一种5’端带3磷酸的oligo rna的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的5’端带3磷酸的oligo rna的制备方法，其特征在于，所述oligo dna双链片段序列为如seq id no:2所示的序列，或为与seq id no:2所示的序列具有80%、90%、95%或98%同源性的序列。

3.根据权利要求1所述的5’端带3磷酸的oligo rna的制备方法，其特征在于，所述oligo rna序列为如seq id no:1所示的序列，或为与seq id no:1所示的序列具有80%、90%、95%或98%同源性的序列。

4.根据权利要求1所述的5’端带3磷酸的oligo rna的制备方法，其特征在于，所述步骤s2中加入t7 rna聚合酶、无机焦磷酸酶、rnase抑制剂和ntp，进行体外转录，合成oligorna。

5.根据权利要求4所述的5’端带3磷酸的oligo rna的制备方法，其特征在于，加入dnaseⅰ消化去除模板dna，用rna磁珠进行回收。

6.根据权利要求1所述的5’端带3磷酸的oligo rna的制备方法，其特征在于，所述步骤s2合成oligo rna后对产物进行纯化，分离出单一长度的oligo rna产物。

7.根据权利要求6所述的5’端带3磷酸的oligo rna的制备方法，其特征在于，通过hplc对产物进行纯化。

8.根据权利要求7所述的5’端带3磷酸的oligo rna的制备方法，其特征在于，纯化后验证产物的均一性和纯度。

9.根据权利要求8所述的5’端带3磷酸的oligo rna的制备方法，其特征在于，通过hplc-ms验证产物的均一性和纯度。

技术总结
本申请涉及生物技术领域，具体公开了一种5’端带3磷酸的oligo RNA的制备方法，先采用β‑乙腈亚磷酰胺合成带有T7启动子的oligo DNA双链片段；再以带有T7启动子的oligo DNA双链片段为模板，体外转录合成oligo RNA。本申请首创了获得5’端带3磷酸的oligo RNA的方法，操作快捷简便，纯度高，对RNA序列、长度等无特殊要求。

技术研发人员：肖潇,杨治东,唐敏,马正耕,尹丹丹
受保护的技术使用者：江苏申基生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15