一种玻璃体样本的单细胞处理方法及其应用

本发明涉及单细胞处理，尤其涉及一种玻璃体样本的单细胞处理方法及其应用。

背景技术：

1、原发性玻璃体视网膜淋巴瘤(primaryvitreoretinallymphoma，pvrl)是原发性中枢神经系统淋巴瘤(primarycentralnervous systemlymphoma，pcnsl)的一个亚型，是一种罕见的致命性眼部恶性肿瘤，97％患者病理类型是侵袭性b细胞淋巴瘤。pvrl常被误诊为葡萄膜炎，94.5％患眼表现为玻璃体白色点状混浊，60.3％患眼表现为视网膜下黄白色浸润灶。由于眼内标本取材、病理诊断困难，该病平均确诊时间13.4个月。

2、pvrl诊断的金标准是病理诊断，然而pvrl是非实体瘤，大量淋巴瘤细胞漂浮于玻璃体腔及散在于视网膜下。为明确诊断，需要做玻璃体切除术，取出玻璃体原液约1.5ml。玻璃体是无色透明的胶状体，主要由水、透明质酸和胶原纤维构成，淋巴瘤细胞与玻璃体胶原纤维粘附在一起，很难游离成为单细胞，并且该瘤细胞极其脆弱，离体2小时即融解从而失去其原始细胞形态。因此，病理诊断阳性率比较低，取而代之的是不同的分子或者基因诊断。

3、为了提高病理诊断阳性率及研究肿瘤细胞的生物学行为，亟需一种有效方法将淋巴瘤细胞从胶栋样玻璃体中分离出来，并且需要保证细胞的纯度、数量和活性，因此，有必要提供一种新的玻璃体样本的单细胞处理方法及其应用解决上述技术问题。

技术实现思路

1、本发明解决的技术问题是提供一种可以得到高活性、高纯度的活性细胞，操作简单快速，且不需要昂贵的仪器设备和试剂，细胞活率高的玻璃体样本的单细胞处理方法及其应用。

2、为解决上述技术问题，本发明提供的玻璃体样本的单细胞处理方法及其应用包括：s1、玻璃体样本的消化液组成为：包括胶原酶、胰酶和分散酶的一种或两种及以上组合，浓度为0.1％-2％，以及0.5％～1.5％fbs溶于pbs；s2、采集患者玻璃体样本后立即置于冰上运输，将组织转移50ml离心管内，并加入s1中10ml的消化液；s3、将离心管置于摇床消化；s4、消化后，加入0.5～1.5mlfbs和2.5～10ml pbs终止；s5、然后800gx5min离心，小心弃上清；s6、裂红1～5min后，用5倍体积pbs稀释后离心；s7、用0.02％～0.06％pbs-bsa或含0.5％～1.5％fbs的pbs清洗1次，离心500gx5min；s8、清洗后，用0.04％pbs-bsa重悬，台盼蓝染色并计数后。

3、优选的，s3中摇床消化温度为37℃，转速为50-100rpm，消化时间10-60min。

4、优选的，s2中采集患者玻璃体样本的体积为1ml。

5、与相关技术相比较，本发明提供的玻璃体样本的单细胞处理方法及其应用具有如下有益效果：

6、本发明提供一种玻璃体样本的单细胞处理方法及其应用，可以得到高活性、高纯度的活性细胞，操作简单快速，且不需要昂贵的仪器设备和试剂，细胞活率最高可达到84％，本发明分离消化方法高效、快速，已经成功从玻璃体中提取高活性和纯度的淋巴瘤细胞，用于单细胞测序研究，适于推广应用。

技术特征：

1.一种玻璃体样本的单细胞处理方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的玻璃体样本的单细胞处理方法及其应用，其特征在于，s3中摇床消化温度为37℃，转速为50-100 rpm，消化时间10-60 min。

3.根据权利要求2所述的玻璃体样本的单细胞处理方法及其应用，其特征在于，s2中采集患者玻璃体样本的体积为1ml。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法在单细胞测序中或流式细胞术检测中等的应用。

技术总结
本发明提供一种玻璃体样本的单细胞处理方法及其应用。所述玻璃体样本的单细胞处理方法包括S1、玻璃体样本的消化液组成为：包括胶原酶、胰酶和分散酶的一种或两种及以上组合，浓度为0.1%‑2%，以及0.5%~1.5%FBS溶于PBS；S2、采集患者玻璃体样本后立即置于冰上运输，将组织转移50 mL离心管内，并加入S1中10ml的消化液；S3、将离心管置于摇床消化；S4、消化后，加入0.5~1.5ml FBS和2.5~10ml PBS终止；S5、然后800 g x5min离心，小心弃上清；S6、裂红1~5min后，用5倍体积PBS稀释后离心。本发明提供的玻璃体样本的单细胞处理方法及其应用具有可以得到高活性、高纯度的活性细胞，操作简单快速，且不需要昂贵的仪器设备和试剂，细胞活率高的优点。

技术研发人员：李雅倩,张美芬,张潇,钱宇婧,石正明
受保护的技术使用者：中国医学科学院北京协和医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15