一种柳蝙蛾肠道内细菌PeB11及其应用

本发明涉及林业害虫防治，具体涉及一种柳蝙蛾肠道内细菌peb11及其应用。

背景技术：

1、水曲柳(fraxinus mandshurica rupr.)别名大叶梣、东北梣，是木犀科(oleacee)白蜡属(fraxinus)的高大落叶乔木。目前作为国家储备林计划的二级保护树种，是东北地区的主要造林和用材树种。近年来在多个地区发现水曲柳树干遭受柳蝙蛾(phassusexcrescens butler)的危害，主要危害水曲柳的树干基部，在枝干中钻蛀坑道，使水曲柳长势衰弱，严重时会导致水曲柳出现风折。

2、因柳蝙蛾幼虫为蛀干害虫，隐蔽性较强，且有较强的适应性和抗逆性，发现时就很难根除，预防时在树下喷施50％硫磷乳油或者采用敌敌畏乳油等化学药物灌注树干，容易造成害虫抗药性增强，且对生态环境并不友好。rnai技术在防治中主要方式是通过注射法、饲喂法、浸泡法等将靶标基因的dsrna导入昆虫体内，使其沉默内源基因，造成昆虫发育障碍、繁殖量减少甚至死亡。在这个过程中均以大肠杆菌为递送菌液，能起到一定的防治效果，但大肠杆菌在虫体中不容易定殖。因此，筛选昆虫自身体内的细菌作为递送靶基因的菌有助于对目标害虫进行定向防治，为有针对性地防治目标害虫提供新菌种资源。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明目的在于提供一种柳蝙蛾肠道内细菌peb11及其应用，可通过对peb11菌株的改造使其成为递送靶基因的菌株，对柳蝙蛾害虫起到针对性防治的作用。

2、为实现上述发明目的，本发明所采用以下技术方案：

3、本发明提供了一种柳蝙蛾肠道内细菌peb11，该菌株是从柳蝙蛾肠道内培养分离获得的，标记为peb11，经鉴定为莱略特氏菌属(lelliottia sp.)细菌。该菌株已保藏，菌株保藏编号为cgmcc no.27404，保藏日期为2023年5月22日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编为100101。

4、本发明所述的柳蝙蛾肠道内细菌peb11是在lb培养基上28℃培养，菌落成乳白色(图1)，将该菌株改造后有望作为饲喂昆虫靶标基因的菌株。其特征在于包括如下步骤：

5、(1)优选地将peb11菌株利用常规方法制备成感受态细胞，pkd46载体(商业购买，pkd46是同源重组基因敲除载体)提取质粒后转化peb11感受态细胞，获得带有pkd46功能的peb11菌株。

6、(2)优选地将l4412pgfp载体(商业购买，pgfp保留天然蛋白的荧光特性，允许融合蛋白在体内定位)提取质粒后转化peb11感受态细胞，获得带有pgfp的peb11菌株。

7、(3)pcr克隆peb11的rnaseⅲ基因及旁侧序列。

8、(4)以pkd4载体(商业购买，基因敲除系统)质粒为模板，用带有rnaseⅲ基因和卡那霉素基因序列的引物进行扩增，将pcr产物转化(1)中获得的带有pkd46功能的peb11菌。因pkd46具有基因编辑功能，因此将敲掉rnaseⅲ基因，敲除之后将菌液42℃培养24-48h，使pkd46丢失，获得敲掉rnaseⅲ基因的peb11菌。

9、(5)将带有抗虫靶基因的质粒转化(4)中获得的基因编辑敲掉rnaseⅲ基因的peb11感受态细胞中，pcr验证其表达情况。

10、(6)扩大培养(5)获得的带有抗虫靶基因的peb11菌，新鲜菌液在5000rpm离心5min，倒去上清后用双蒸水按照两倍体积比例重悬菌体，将重悬菌液喷洒在植物上，进行喂虫实验，同时用相同的方法收集(2)中获得的带有pgfp的peb11菌体，作为喂虫时的对照，检测peb11菌是否在昆虫肠道中。

技术特征：

1.一种柳蝙蛾肠道内细菌peb11及其应用，其特征在于：所述柳蝙蛾肠道内细菌为莱略特氏菌属(lelliottia sp.)细菌，菌株标记为peb11，于2023年5月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为：cgmcc no.27404。

2.根据权利要求1所述的一种柳蝙蛾肠道内细菌peb11及其应用，其特征在于：权利要求1所述莱略特氏菌属(lelliottia sp.)细菌来自于柳蝙蛾肠道内存在的细菌。

3.根据权利要求1所述的一种柳蝙蛾肠道内细菌peb11及其应用，其特征在于：对peb11菌株进行改造，可以应用于饲喂法递送靶基因的递送菌株，包括如下步骤：

技术总结
本发明公开了一种柳蝙蛾肠道内细菌PeB11及其应用，通过对柳蝙蛾肠道内细菌的培养，鉴定，确定筛选到的菌株为莱略特氏菌属(Lelliottia sp.)细菌，并标记为PeB11，于2023年5月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为：CGMCCNo.27404。通过对PeB11菌株的改造，基因编辑敲掉RNaseⅢ基因，将抗虫基因的靶基因质粒转化敲掉RNaseⅢ基因的PeB11菌感受态细胞中，收集菌体，可以作为饲喂法递送靶基因的菌株。本发明为有针对性地防治目标害虫提供新菌种资源。

技术研发人员：景天忠,齐凤慧
受保护的技术使用者：东北林业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15